K2-ET02 通用型磁珠法宿主残留DNA样本前处理试剂盒2.0

 

通用型磁珠法宿主残留DNA样本前处理试剂盒2.0

使用说明书

试剂盒简介

本试剂盒适用于生物制品样本中宿主残留DNA检测的前处理。采用磁珠法DNA提取原理，可最大限度的分离纯化样本中的宿主残留DNA，实现从不同复杂基质中回收微量DNA样本。采用高吸附的磁珠和优化的缓冲体系，可高效稳定地提取样本中的微量宿主细胞残留DNA，对复杂样本的耐受性强，30 min即可完成提取实验。

该前处理试剂盒可与本公司的多种宿主细胞残留DNA检测试剂盒（qPCR法）配套使用，包括E.coli残留DNA检测试剂盒（Cat#K2-HCD01）、CHO宿主细胞残留DNA检测试剂盒（Cat#K2-HCD02）和Vero宿主细胞残留DNA检测试剂盒（Cat#K2-HCD03）等。

 

试剂盒组分

规格：25 Extracts /100 Extracts

序号	组分编号	组分名称	25 Extracts	100 Extracts	储存条件
组分I*	ET02-A	裂解结合液	15 mL/瓶×1瓶	60 mL/瓶×1瓶	室温
	ET02-B	洗涤液A*	6 mL/瓶×1瓶 （需加9 mL乙醇）	24 mL/瓶×1瓶 （需加36 mL乙醇）	室温
	ET02-C	洗涤液B*	3 mL/瓶×1瓶 （需加12 mL乙醇）	12 mL/瓶×1瓶 （需加48 mL乙醇）	室温
	ET02-D	洗脱液	2.5 mL/瓶×1瓶	10 mL/瓶×1瓶	室温
	ET02-E	磁珠悬浮液	0.5 mL/支×1支	1 mL/支×2支	室温
组分II	ET02-F	蛋白酶K（20 mg/mL）	0.5 mL/支×1支	1 mL/支×2支	-20±5℃
	ET02-G	糖原	225 μL/支×1支	900 μL/支×1支	-20±5℃
	ET02-H	PolyA钾盐	150 μL/支×1支	600 μL/支×1支	-20±5℃
	ET02-I	核酸助沉剂	100 μL/支×1支	400 μL/支×1支	-20±5℃

注：组分I需常温保存，不可冷冻。洗涤液A在使用前需加入9 mL（25 Extracts）或36 mL（100 Extracts）乙醇，洗涤液B在使用前需加入12 mL（25 Extracts）或48 mL（100 Extracts）乙醇，并做好标记；试剂在使用前需充分混匀；使用后将瓶盖盖紧，以防止乙醇挥发。如长期保存可将磁珠悬浮液置于4℃，确保磁珠结合活性。

有效期

规定储存条件下12个月，具体详见试剂盒标签。

 

 

运输条件

组分I室温运输；组分II冰袋或干冰运输。

收到货后，请检查组分I和组分II的试剂是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 检测之前请仔细阅读本说明书，按照说明书内容进行规范操作，样本处理建议在超净台或生物安全柜中进行。
2. 使用该试剂盒前，注意观察常温保存溶液是否有析出或者沉淀，若溶液发生沉淀，放置于37℃水浴中，以溶解沉淀。试剂使用前请振荡混匀并瞬时离心至管底。
3. 吸取样本时应尽量避免吸入磁珠，磁珠易沉淀使用前请振荡混匀。
4. 试剂使用结束后尽快放置推荐的储存条件下，避免在常温或高温条件下存放时间过长。
5. 所用Ep管、枪头等耗材需无菌、无核酸酶。

 

实验所需但试剂盒中未含材料

• 10 μL、100 μL、1000 μL不等的低吸附带滤芯枪头
• 1.5 mL低吸附离心管
• 96孔/32孔深孔板（推荐Cat#50054205）
• 磁棒套（推荐Cat#50056698）
• 无水乙醇（分析纯）
• 1×PBS缓冲液（pH 7.4，无Mg²⁺和Ca²⁺离子），无菌，无核酸酶
• 超纯水（Cat#S02010）

 

实验所需但试剂盒中未含设备

• 漩涡振荡器
• 水浴锅或金属浴
• 瞬时离心机
• 磁力架
• 全自动核酸提取仪（推荐捷诺GenAct NR-96）
• 10 μL、100 μL、1000 μL量程不等的移液器
• 超净台或生物安全柜

 

提取操作过程——手动提取

1. 样本制备

1.1 待测样本为疫苗等本身含有较高的DNA含量的样本，为了保证检测的准确性，使样品的检测值在标准曲线线性范围之内，可用1×PBS（pH7.4，无Mg²⁺和Ca²⁺离子）、样品保存液或1×TE溶液对样本进行适当比例稀释后提取，样本稀释后，以稀释液作为阴性样本。

1.2 待测样本为干粉的，可用超纯水或1×PBS将样本稀释成10 mg/mL或者100 mg/mL后使用。

1.3 待测样本为复杂背景基质的，可根据需要进行加标回收实验，以确定合适的样本稀释倍数。

1.4 一般情况下生物制品纯化过程中间样品的pH值均为中性，若样品的pH<5或者pH>9，可能会影响样品前处理效果。若样品的pH值不为中性且对回收率的影响较大，可考虑用1M的盐酸或氢氧化钠调整样品的pH至中性后（pH 6.0～8.0）再进行纯化操作。

1.5 为了确保结果的准确性，每个待测样本建议至少进行2次DNA提取处理。

1.6 每次实验中需要设置一个阴性样本NCS，与其余样本一起处理，以检验样本处理过程中是否存在污染。

1.7 用加标回收样本（ERC）来评估DNA提取的回收率和准确度，并可用ERC来评估验证分析方法和系统性能。对具体样品的DNA加标量设定在其无加标测试值的2-10倍为宜（可参考相应的宿主细胞残留DNA检测试剂盒）。

2. 裂解结合

2.1 将100 µL的样本，阴性样本和加标回收样本分别加入1.5 mL的离心管中，每管中加入600 μL裂解结合液和20 μL蛋白酶K，涡旋混匀10 sec。

注：对于核酸含量残留极低或回收率较低的样本，可尝试加入9 μL糖原、6 μL PolyA钾盐和4 μL核酸助沉剂进行提取。

2.2 在样品混合物中加入20 µL磁珠，涡旋混匀后，60℃恒温震荡15 min。

注：磁珠使用前应在漩涡振荡器充分振荡5 sec；如果样品较多，每次加入磁珠过程中应再次充分震荡混匀磁珠，以保证每次加入的磁珠量的一致性。如样本基质复杂，可尝试将孵育温度提高至75℃。

2.3 短暂离心收集悬液至管底，然后将离心管置于磁力架上，室温静置至溶液澄清（等待磁珠完全分离的时间约为1-2 min）。

2.4 保持离心管于磁力架上，避免震动，用1 mL移液器小心吸去大部分溶液。

注：去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。

2.5 继续保持离心管于磁力架上1min，用200 µL移液器吸去残余上清。

3. 洗涤

3.1 加入500 μL洗涤液A（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），涡旋混匀，确保磁珠分散，离心管壁无聚集磁珠。

3.2 瞬时离心后将离心管重置于磁性分离架上，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第1次磁珠洗涤。

3.3 加入500 μL洗涤液B（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），涡旋混匀，确保磁珠分散，离心管壁无聚集磁珠。

3.4 瞬时离心后将离心管重置于磁性分离架上，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第2次磁珠洗涤。

3.5 为保证液体充分移除，可将离心管再次瞬时离心10 sec，置于磁性分离架上，待磁珠完全分离后，用    10 μL枪头小心地将残余液体吸除干净。

3.6 打开管盖，室温放置2-5 min直至乙醇完全挥发。肉眼观察到磁珠表面无反光或出现裂隙即表明乙醇已挥发完全。

注：避免磁珠过分干燥，导致磁珠粘在管壁上降低回收率。

4. 洗脱

4.1 将离心管放入常规离心管架，沿离心管壁加入50-100 μL 70℃预热的洗脱液，用漩涡振荡器轻微振荡    5 sec使磁珠和洗脱液混匀，瞬时离心后，70℃孵育3 min，孵育过程中可再次振荡混匀1次。

注：振荡后需将残留于管壁上的磁珠和洗脱液轻甩至管底，振荡至管盖上的磁珠和洗脱液需快速离心后重新震荡混匀。

4.2 孵育后瞬时离心，将离心管盖上吸附的液体收集到底部后，将离心管置于磁力架上静置2 min，等待样本温度恢复到室温水平，磁珠成团贴壁，液体变清澈；

4.3 将DNA溶液移至新的1.5 mL离心管中，随即进行样本检测。短期保存于-20℃，长期保存需放置于-80℃。

操作注意细节

• 在磁珠洗涤或洗脱过程中，每次震荡混匀后都要用瞬时离心机短暂离心，以保证没有磁珠液附着在离心管管盖和管壁上；
• 磁珠的干燥时间依具体情况而定，室温较高或空气干燥的环境下可以选择较短干燥时间；而室温较低或空气湿润环境下，干燥时间可以稍长；
• 在去除乙醇干燥时，观察磁珠状态，勿让磁珠太干，以免洗脱不完全；
• 尽量在完成样品前处理纯化后就立即进行后续DNA检测，以保证检测结果的准确性。

 

提取操作过程——自动化提取

1. 样本制备

样本制备同手动提取过程。

2. 自动化提取——匹配捷诺GenAct NR-96
3. 2.1 装板：按照下表向96孔/32孔深孔板中加入相应试剂：

板位	试剂名称	体积/孔
1	样本/阴性样本/加标回收样本	100 μL
	裂解结合液	600 μL
	蛋白酶K	20 μL
2	洗涤液A*	500 μL
3	磁珠悬浮液	20 μL
	洗涤液B*	500 μL
6	洗脱液	50-100 μL

注1：洗涤液A^*和洗涤液B^*使用前请先检查是否已加入无水乙醇。

注2：（可选）对于核酸含量残留极低或回收率较低的样本，可在板位1中尝试加入9 μL糖原、6 μL PolyA钾盐和4 μL核酸助沉剂进行提取。

注3：磁珠使用前应在漩涡振荡器充分振荡5 sec；如果样品较多，每次加入磁珠过程中应再次充分震荡混匀磁珠，以保证每次加入的磁珠量的一致性。

2.2 上机：将磁棒套插到仪器中并确认插入到位，将96孔/32孔深孔板放到对应的板位上，参考下表设置程序并运行：

名称	板位	体积 （μL）	震荡速度 （rpm）	震荡时间 （sec）	磁吸时间 （sec）	温度 （℃）	等待时间 （sec）
吸磁	3	500	500	12	60	/	0
裂解	1	700	500	900	90	75	0
洗涤	2	500	600	30	60	/	0
洗涤	3	500	600	30	60	/	120
洗脱	6	100	800	180	90	70	0
弃磁	3	500	500	12	0	/	0

2.3 程序运行结束后，将6号板位上深孔板内的洗脱液移至新的1.5 mL离心管中。随即进行样本检测。短期保存于-20℃，长期保存需放置于-80℃。

注：收集洗脱液时，应尽量将离心管内溶液转移完全，否则将影响样品检测的准确性。

操作注意细节

• 向深孔板中加样时，应尽量加至底部，避免影响溶液震荡混匀效果。
• 尽量在完成样品前处理纯化后就立即进行后续DNA检测，以保证检测结果的准确性。