K4-PF01蛋白酶荧光检测试剂盒
蛋白酶荧光检测试剂盒
使用说明书
（96T）
使用前请仔细阅读说明书（注意事项），避免浪费您的时间和成本。
试剂盒说明
蛋白酶荧光检测试剂盒提供检测蛋白酶活性的主要试剂。检测蛋白酶活性的方法是使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的酪蛋白作为底物。蛋白酶活性使底物裂解成较小的片段，导致荧光淬灭的减少（即相对荧光单位的增加），测量相对荧光单位变化，即可用来检测蛋白酶活性。
注意：试剂盒仅供研究和工业使用。不用于药物、家庭或其他用途。
试剂盒组成及保存
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中文名称 |
规格 |
储存条件 |
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底物（20X） |
10支（0.25 mg/支） |
2-8℃，避免日光直射 |
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孵育缓冲液（10X） |
20 mL/瓶×2瓶 |
2-8℃ |
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检测缓冲液（1X） |
100 mL/瓶×1瓶 |
2-8℃ |
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终止液（10X） |
4支 |
2-8℃ |
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胰蛋白酶标准品 |
1支（0.1 mg/支） |
2-8℃ |
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复溶缓冲液（1X） |
1支 |
2-8℃ |
试验所需自备物品
- 高精度移液器，EP管及一次性吸头，黑色96孔板
- 微量离心机，荧光酶标仪（激发波长485 nm，发射波长535 nm），洁净工作台，孵育箱
- 超纯水
检测前准备工作
- 试剂盒及仪器准备
提前30分钟从冰箱中取出需要的试剂平衡至室温，提前30分钟打开洁净工作台紫外灯灭菌，提前15分钟打开酶标仪预热。（或根据设备需要提前预热）
- 孵育缓冲液稀释
计算工作液体积，在洁净工作台内，取适量，用超纯水稀释10倍（v/v）为1×后使用，现配现用。
- 终止液稀释
计算工作液体积，在洁净工作台内，取适量，用超纯水稀释10倍（v/v）为1×后使用，现配现用。
- 底物溶液配制
将底物管10000转/分钟离心1分钟使粉末落入管底。加入1 mL超纯水，轻柔颠倒混匀（难溶解部分可用吸头缓慢吹打混匀），即为0.25 mg/mL底物溶液。未使用完的底物分装成更小的体积，以避免反复冻融。反复冻融，背景可能会略微增加。分装样品应避光储存在-20±5℃。
- 标准品储备液配制
将标准品管10000转/分钟离心1分钟使粉末落入管底。加入100 μL复溶缓冲液（1×，试剂盒自备），轻柔颠倒混匀，制成1 mg/mL储备液。注：将标准品储备液分装成5-10 μL一支，储存在-70℃以下或-20±5℃，以减少冻融次数。
- 样品溶液准备
保证样品溶液蛋白浓度≤0.25 mg/mL，若浓度较高，用孵育缓冲液稀释（孵育缓冲液为20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.5 @25℃）
- 样品空白对照
使用与待测样品组分一致的溶液作为样品空白对照，如果组分不明确，可使用孵育缓冲液。
储存稳定性
- 底物对光敏感，应在2-8℃黑暗（试剂盒带的铝箔袋）中储存。如果储存得当，底物稳定1年。
- 孵育缓冲液、检测缓冲液、反应终止液在2–8℃下稳定2年。使用时注意在洁净工作台内操作，减少污染。
- 胰蛋白酶标准品：粉末未开封时在2–8℃稳定2年。配好的标准品储备液分装后储存在-20±5℃可稳定2年。
检测程序
- 胰蛋白酶标准品工作液配制
注意：为防止污染，建议在洁净工作台中制备标准品工作液。
标准品工作液：取胰蛋白酶标准品储备液（1 mg/mL），用孵育缓冲液10倍梯度稀释至50 ng/mL工作液，可用于加样反应中孵育1小时的实验。稀释至2 ng/mL工作液，可用于加样反应中孵育24小时的实验。
标准品空白对照：孵育缓冲液。
- 加样反应
注意：为防止污染，建议在洁净工作台中加样。
取4支无菌EP管，按表1所示进行加样反应。
表1. 实验流程表
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步骤 |
溶液名称 |
标准品空白对照组 |
标准品组 |
样品空白对照组 |
样品组 |
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加样 |
底物工作液 |
100 μL |
100 μL |
100 μL |
100 μL |
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样品空白对照 |
— |
— |
10 μL |
— |
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样品 |
— |
— |
— |
10 μL |
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标准品空白对照 |
10 μL |
— |
— |
— |
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标准品 |
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10 μL |
— |
— |
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孵育 |
37±2℃孵育箱中黑暗孵育1小时或24小时。 |
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终止 |
孵育后，每个EP管中加入300 μL稀释后的反应终止液。37±2℃孵育箱中黑暗孵育30分钟。 |
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离心，取上清 |
10000转/分钟离心3分钟，取10 μL上清用于荧光测量。 |
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荧光测量 |
将10 μL上清液加到含1 mL检测缓冲液的EP管中，轻轻颠倒混匀，吸取200 μL到黑色96孔板里，作2个复孔判断结果。设置激发波长为485 nm，监测发射波长为535 nm，立即读数。 |
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注：
1）离心取上清时，避免吸入沉淀，如较难吸取上清，可延长离心时间至10分钟，或离心3分钟后取50 μL至新EP管再次离心3分钟。
2）整个实验过程避免强光照射（如较强的阳光）。
结果判断
检出限（LOD）：
本检测的检出限（LOD）是指能产生显著荧光读数、且高于标准品空白对照的蛋白酶最低量。标准品组的荧光读数应大于标准品空白对照组的120%。检测限会因仪器灵敏度的不同而有所差异。可通过梯度稀释胰蛋白酶对照溶液来制备不同浓度的对照溶液。
本实验孵育1 h检测中，标准品组含有500 pg的胰蛋白酶，此方法可检测到最低500 pg的胰蛋白酶。若孵育24 小时检测中，标准品组含有20 pg的胰蛋白酶。
此外，胰蛋白酶标准品溶液也可通过连续稀释，用于绘制标准曲线。
结果判断：满足检出限，且样品组的荧光读数不大于样品空白对照组的120%，判断为无检出。若样品组荧光读数达到样品空白组荧光值的120%，则视为具有显著性，判断为检出。
注意事项
- 为提高本实验的回收率，推荐反应体系中：底物蛋白总量∶样品中蛋白总量≥1∶1。
- 注意在洁净工作台内稀释缓冲液和加样，避免试剂盒缓冲液污染影响结果判断。
- 底物对光敏感，应在2-8℃黑暗（试剂盒带的铝箔袋）中储存。底物短暂暴露在室内光线下不影响使用，如操作时间过长可用锡箔纸包裹底物工作液。
- 底物和胰蛋白酶标准品容易产生气泡，且底物本身有荧光强度，因此在底物溶解、标准品稀释、反应液加入96孔板等过程中，注意移液操作，特别注意避免将气泡加入96孔板中。
- 注意酶标仪的增益设置可能造成信号过低或过高而超出检测限，测定时调整到合适的增益值。
问题分析
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问题描述 |
相应对策 |
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确保仪器增益设置足够低，以避免使仪器探测器饱和。对于包含多个激发/发射位置的荧光读取器，请确保为激发/发射设置选择了“顶部/顶部”。 |
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移液过程中的变化可以直接导致分析误差，因为底物工作液本身有一些固有的背景荧光。使用反向移液或其他技术，以防止引入小气泡进入板孔。 |
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离心后取上清时取到了沉淀，可延长离心时间，或按照说明书离心两次。 |
