K4-SRT 胰蛋白酶快速酶切试剂盒

胰蛋白酶快速酶切试剂盒

使用说明书 

（暂行版） 

使用前请仔细阅读说明书（注意事项），避免浪费您的时间和成本。

试剂盒说明

蛋白质酶切对于蛋白质结构表征、蛋白质鉴定和蛋白质修饰监测至关重要。胰蛋白酶可特异性切割精氨酸和赖氨酸残基的羧基侧肽键，是一种经常被选择使用的蛋白质消化酶。胰蛋白酶酶切试剂盒提供了进行蛋白质酶切的必要试剂，可快速进行包括变性，还原，烷基化在内的完整的胰蛋白酶消化。

试剂盒中的胰蛋白酶是雅心自产高纯度和经修饰的测序级重组胰蛋白酶，该酶不具有糜蛋白酶活性，无需TPCK抑制，具有极低程度的自切活性。

试剂盒用途

试剂盒仅供研究和工业使用。不用于药物、诊断或其他用途。

试剂盒组成及保存

程序

1. 检查所需但未提供的材料和设备

1. 高精度移液器，EP管及一次性吸头。
2. LC-MS相关设备，离心机，水浴锅等。
3. 超纯水（18.2Ω）、LC-MS级甲酸、乙腈等相关试剂。

2. 准备工作

注意：以下是推荐的溶液配制方式，也可根据实际需要进行调整。

1. 取一支盐酸胍（GuHCl），加入4 mL酶切缓冲液，充分溶解，配制成7-8 M GuHCl溶液.
2. 取一支二硫苏糖醇（DTT），短暂离心使粉末落在管底，加入62.5 μL超纯水，充分溶解，配成1 M DTT溶液，现配现用。
3. 取一支碘乙酰胺（IAM），短暂离心使粉末落在管底，加入125 μL超纯水，充分溶解，配成1 M IAM溶液，现配现用。
4. 取一支测序级胰蛋白酶，短暂离心使粉末落在管底，加入20 μL复溶缓冲液，充分溶解，配成5 mg/mL酶液，可分装成小体积储存在-20±5℃，避免反复冻融。
5. 计算需使用的甲酸体积，用超纯水配制10%甲酸水溶液（v/v）。

3. 样品处理

注意：以下是推荐的样品处理方式（蛋白样品浓度为5 mg/mL），也可根据实际需要进行调整。确保样品在每个反应步骤中混合均匀。

1. 将50 µL配制好的7-8 M GuHCl加入EP管中。
2. 加入2 µL配制好的1M DTT并混匀。
3. 加入20 µL蛋白样品（5 mg/mL）并混匀。
4. 注意：起始蛋白样品的浓度为5 mg/mL。如果样品大于5 mg/mL则需要将样品稀释到5 mg/mL。如果小于5 mg/mL则需要将样品浓缩到5 mg/mL。也可按照样品处理部分各试剂的比例，根据实际需要调整。
5. 混合均匀，盖上盖子，在56℃条件下反应30分钟（反应条件可根据需要调整）
6. 加入4 µL 1M IAM。
7. 混合均匀，盖上盖子，在室温、避光条件下反应30分钟（反应条件可根据需要调整）

4. 酶切

注意：以下是推荐的酶切方式，也可根据实际需要进行调整。

1. 脱盐：使用脱盐柱或浓缩管，将样品脱盐并置换到酶切缓冲液（试剂盒提供100 mM Tris-HCl，pH7.5，也可选择其他合适的缓冲液）中，测定脱盐后样品浓度，用酶切缓冲液稀释至0.5 mg/mL。

稀释：如不进行脱盐，可将样品中的GuHCl稀释到2 M或以下浓度。按照步骤C的反应体系，GuHCl浓度约4.6-5.3 M，因此可以在C的反应体系中加入124 µL酶切缓冲液，此时GuHCl浓度被稀释为1.7-2 M，蛋白样品的浓度约为0.5 mg/mL，稀释液体积为200 µL。（如需要更大的稀释倍数，则蛋白浓度降低，应相应降低胰蛋白酶加入量，确保酶与蛋白的质量比（E:P）合适，同时提高LC-MS上样量）

2. 酶切：将200 µL已脱盐或稀释的蛋白样品（0.5 mg/mL）加入EP管中，加入1 µL，5 mg/mL胰蛋白酶（E:P=1:20），混匀后37℃孵育1 h。

注意：试剂盒给出的酶切参数为E:P=1:20，37℃，pH7.5，1 h快速酶切反应，可根据需要优化酶切参数E:P、温度、pH、时间。

3. 酸化：酶切后加入4 µL，10%甲酸水溶液，酸化后肽段终浓度约0.48 mg/mL（此浓度为按照步骤C的反应体系的终浓度，如按照其他方式进行反应或稀释，应计算肽段终浓度）。
4. LC-MS：根据分析方法设置相应仪器程序，取酸化后样品立即进行分析，上样量1~10 µg。

注意事项

1. 脱盐/稀释

当溶液中胍盐浓度较高时，胰蛋白酶活性会受到抑制。可通过脱盐或稀释的方法，将胍盐浓度降低至1-2 M以下。

2. 酶切

酶切反应参数中，酶及蛋白的质量比（E:P）、温度、pH、酶切时间会影响蛋白样品的酶切程度，如酶切不完全会导致形成含赖氨酸或精氨酸的大分子肽，影响序列覆盖度或肽段总丰度。试剂盒推荐的酶切参数为E:P=1:20，37℃，pH7.5，1h快速酶切反应。也可根据不同蛋白或实验条件的需要对酶切参数进行优化。

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