K2-HCD04 HEK293宿主细胞残留DNA检测试剂盒 （qPCR-荧光探针法）
试剂盒简介
HEK293宿主细胞残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的HEK293宿主细胞残留DNA含量的专用试剂盒。本试剂盒利用探针法荧光定量PCR原理，定量检测样品中HEK293宿主细胞残留DNA含量。专一性强、检测快速、性能稳定，最低检测限可以达到fg水平。
本试剂盒配套专为重组载体类制品开发的裂解缓冲液，腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV）和腺病毒（AdV）样品不需要提取纯化DNA，仅进行简单的稀释裂解即可直接用作模板进行PCR扩增检测。
本试剂盒添加了dUTP/UDG防污染系统，可消除扩增产物造成的气溶胶等污染。
试剂盒组分
规格：100 Reactions
表1 试剂盒组分
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组分 |
组分编号 |
100 Reactions |
储存条件 |
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HEK293 qPCR Mix |
HCD04-A |
800 μL×2管 |
-20 ℃及以下 |
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HEK293 Primer&Probe Mix |
HCD04-B |
550 μL |
-20 ℃及以下，避光 |
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HEK293 DNA定量参考品 （30 ng/μL） |
HCD04-C |
50 μL |
-20 ℃及以下 |
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DNA稀释液 |
HCD04-D |
1.5 mL×4管 |
-20 ℃及以下 |
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裂解缓冲液 |
HCD04-E |
700 μL |
-20 ℃及以下 |
有效期
规定储存条件下1年，具体详见试剂盒标签。
适用机型（包括但不限于）
Thermo Scientific：ABI 7500、QuantStudio™ 5、ABI StepOnePlus
Bio-Rad：CFX96
上海宏石：SLAN-96S
所需器材
仪器：移液器、漩涡混匀仪、瞬时离心机、qPCR仪
材料：EP管、PCR管、八联管、移液吸头等
注意事项
（1）检测之前请仔细阅读本说明书，按照说明书内容进行规范操作。
（2）每个组分使用前请振荡混匀并瞬时离心至管底。
（3）加样和配液过程请在超净台中分区进行。
（4）试剂使用结束后尽快放置推荐的储存条件下，避免在常温或高温条件下存放时间过长。
（5）所用EP管、PCR管、吸头等耗材需无菌、无核酸酶。
操作过程
一、HEK293 DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备
HEK293 DNA定量参考品的浓度标注于管壁标签，请确认后再进行稀释。
以HEK293 DNA定量参考品30 ng/μL为初始浓度，用DNA稀释液将参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。具体操作如下：
1.1将试剂盒中的DNA定量参考品和DNA稀释液置于低温或室温下融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 sec，重复2-3次确保充分混匀。
1.2取6支洁净的1.5 mL EP管，分别标记为3 ng/μL，ST①，ST②，ST③，ST④，ST⑤。
1.3在标记为3 ng/μL的EP管中加入90 μL DNA稀释液和10 μL DNA定量参考品（30 ng/μL），即稀释为3 ng/μL，瞬时振荡混匀后快速离心3-5 sec，重复2-3次确保定量参考品与DNA稀释液充分混匀。
1.4在ST①，ST②，ST③，ST④，ST⑤管中先分别加入90 μL DNA稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下：
表2 HEK293 DNA定量参考品的稀释
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稀释管 |
稀释比例 |
终浓度 |
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ST① |
10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA稀释液 |
300 pg/μL |
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ST② |
10 μL ST①+90 μL DNA稀释液 |
30 pg/μL |
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ST③ |
10 μL ST②+90 μL DNA稀释液 |
3 pg/μL |
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ST④ |
10 μL ST③+90 μL DNA稀释液 |
300 fg/μL |
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ST⑤ |
10 μL ST④+90 μL DNA稀释液 |
30 fg/μL |
注:
- 初次使用时建议将DNA定量参考品分装储存，减少反复冻融次数和避免污染。
- 标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，如需要可适当扩大或缩小线性范围。
- 每个梯度稀释时需轻微振荡并瞬时离心后再吸取，确保模板完全混匀。
- 使用带滤芯的吸头，并每次更换吸头，注意规范操作，避免管与管直接的交叉污染。
二、不同对照样品的制备
2.1 待测样品
2.1.1 待测样品为DNA样品或已纯化的DNA时，可直接作为待测样品DNA模板。
2.1.2 待测样品为AAV、LV或AdV时，则进行以下稀释和裂解处理。
（1）样品稀释：用移液器吸取5 μL样品并加入DNA稀释液进行稀释，漩涡混匀5-10 sec后快速离心3-5 sec，得到稀释后待测样品。稀释倍数应根据纯化工艺进行确认。稀释50倍可以参考下表。
表3 样品稀释
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样品编号 |
稀释方法 |
稀释倍数* |
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S1 |
5 μL样品 + 45 μL DNA稀释液 |
10 |
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S2 |
10 μL S1 + 40 μL DNA稀释液 |
50 |
注:未计算裂解时的稀释倍数
（2）裂解：吸取25 μL稀释后的待测样品，并加入25 μL裂解缓冲液，漩涡混匀5-10 sec后快速离心3-5 sec，于37℃ 10 min，60℃ 5 min孵育，得待测样品DNA模板。注意加入裂解缓冲液后放在冰上转移并尽快开始孵育。
注:裂解过程同时将样品稀释了一倍。例如稀释过程中将样品稀释了50倍，裂解时又稀释了一倍，则原始样品总稀释倍数为100倍。裂解缓冲液是专为重组载体类制品开发的裂解液，并进行充分验证，其他类样品应先验证是否适用，或选择其他裂解液及提取纯化试剂。
2.2 样品加标回收质控ERC（Extraction Recovery Control）的制备
根据需要设ERC中的HEK293 DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL的HEK293 DNA样品为例）。具体操作如下：
（1）取50 μL待测样品（Test Sample，TS）加入1.5 mL洁净的EP管中，再加入50 μL ST③，混匀，标记为加标回收ERC；
（2）加标回收ERC和同批待测样品一起进行样品前处理，制备加标回收ERC纯化液。
2.3 标准品回收质控SRC（Standards Recovery Control，SRC）的制备（可选）
根据需要设SRC中的HEK293 DNA 标准品浓度（以制备加3 pg/μL的HEK293 DNA样品为例），具体操作如下：
（1）取100 μL ST③加入1.5 mL洁净的EP管中，标记为标准品回收SRC；
（2）标准品回收SRC和同批待测样品一起进行样品前处理，制备标准品回收SRC纯化液。
2.4 阴性质控NCS的制备
根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
（1）取100 μL样品基质溶液（或DNA稀释液）加入1.5 mL洁净的EP管中，标记为阴性质控NCS；
（2）阴性质控NCS和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。
2.5 无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC，无模板对照NTC无需进行样品前处理，在qPCR反应液的制备和加样阶段开始配制即可。
三、qPCR反应液的制备和加样
3.1 根据所要检测的标准曲线和待测样品数量，计算所需反应孔数，每个样品通常需做3个重复孔。
反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线 + 1个阴性质控NCS + 1个无模板对照NTC + n个样品加标回收质控ERC + n个待测样品 + 标准品回收质控SRC(可选)）× 3
通常推荐每个待测样品都需要做ERC，如几个待测样品为同一产品，可只做一个。
3.2根据反应孔数，将除模板外的组分混合成qPCR Mix反应液，各试剂置于室温或低温下融化，轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 sec，重复2-3次确保充分混匀，加样。
qPCR Mix反应液=（反应孔数+2）×15 μL HEK293 qPCR Mix +（反应孔数+2）×5 μL HEK293 Primer&Probe Mix（含有2孔的损失量，如检测样本较多，可适当增加）
表4 qPCR Mix反应液配制
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组分 |
体积 |
|
HEK293 qPCR Mix |
15 μL |
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HEK293 Primer&Probe Mix |
5 μL |
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Total |
20 μL |
3.3将配制的qPCR Mix反应液轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 sec，重复2-3次确保充分混匀，分装，加入DNA模板（如下表所示）。加样完成后密封好管子，低速离心后混匀再低速离心，完全混匀反应液，如有气泡，需将气泡排尽。
表5各反应孔加样示例
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样品/编号 |
加样 |
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标准曲线 |
20 μL qPCR Mix反应液 + 10 μL标准曲线样品（ST①/ST②/ST③/ST④/ST⑤） |
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NTC |
20 μL qPCR Mix反应液 + 10 μL DNA稀释液 |
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NCS |
20 μL qPCR Mix反应液 + 10 μL阴性质控NCS纯化液 |
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待测样品 |
20 μL qPCR Mix反应液 + 10 μL 待测样品纯化液 |
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样品ERC |
20 μL qPCR Mix反应液 + 10 μL样品ERC纯化液 |
3.4 根据样品数量，参考下表进行96孔板排位。
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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A |
NTC |
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S1 ERC |
S1 ERC |
S1 ERC |
S1 |
S1 |
S1 |
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B |
NTC |
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ST① |
ST① |
ST① |
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S2 ERC |
S2 ERC |
S2 ERC |
S2 |
S2 |
S2 |
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C |
NTC |
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ST② |
ST② |
ST② |
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S3 ERC |
S3 ERC |
S3 ERC |
S3 |
S3 |
S3 |
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D |
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ST③ |
ST③ |
ST③ |
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S4 ERC |
S4 ERC |
S4 ERC |
S4 |
S4 |
S4 |
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E |
NCS |
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ST④ |
ST④ |
ST④ |
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S5 ERC |
S5 ERC |
S5 ERC |
S5 |
S5 |
S5 |
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F |
NCS |
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ST⑤ |
ST⑤ |
ST⑤ |
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G |
NCS |
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SRC |
SRC |
SRC |
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|
H |
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|
|
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注: 该示例展示的是用本试剂盒检测5个样品的HEK293 DNA残留量
包括：5个浓度梯度的HEK293 DNA标准曲线（ST① - ST⑤）、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、5个样品加标回收质控ERC、5个待测样品S、1个标准品回收质控SRC。每个样本做3个重复孔。
四、扩增程序参数设置
在荧光定量PCR仪器上进行扩增程序设置：设置反应体积30 μL，FAM通道。
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循环步骤 |
温度（℃） |
时间 |
循环数 |
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UDG消化 |
37℃ |
10 min |
1 |
|
预变性 |
95℃ |
30 sec |
1 |
|
变性 退火/延伸（收集荧光） |
95℃ 60℃ |
15 sec 30 sec |
40 |
以ABI 7500 v2.3为例
- 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。在Experiment Properties界面选择7500（96 Wells）、Quantitation-Standard Curve、TaqMan Reagents。
- 在Plate Setup界面设置检测探针和样本。在“Define Targets and Samples”面板中创建1个检测探针（Define Targets），命名为“HEK293 DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，淬灭基团为“none”；创建样本（Define Samples），ST① - ST⑤、NTC、NCS、ERC、S、SRC。
- 在“Assign Targets and Samples”面板中，将标准曲线的“Task”一栏设置为“Standard”（
），并在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（即每孔加入的参考品浓度，单位为fg/μL），对应样本（Sample）一栏选择“ST①”、“ST②”、“ST③”、“ST④”、“ST⑤”；无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“Negative Control”（
），对应样本（Sample）一栏选择“NTC”；将阴性质控NCS孔、样品加标回收质控ERC孔、待测样品孔和标准品回收质控SRC孔（可选）的“Task”一栏设置为“Unknown”（
），对应样本（Sample）一栏选择“NCS”、“ERC”、“S”和“SRC”。 - 在“Run Method”面板中，按扩增程序参数设置反应程序，反应体积为30 μL。
- 点击右上角的“START”开始程序。
五、结果分析
以ABI 7500 v2.3为例
进入Analysis板块
- 在Amplification Plot界面中，系统会自动给出Threshold，可根据需要手动调节Threshold至合适位置，结束后点击“Analyze”。可以在“Multiple Plots View”查看扩增曲线形态是否正常，如果三个复孔中其中一个差异较大，可舍去。
- 在Standard Curve界面中，读取标准曲线的R2、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Y-Inter）等。正常的标曲：R2>0.99；扩增效率在90%-110%之间。
- 在右边的“View Well Table”面板中，“Quantity”一栏中可以读取不同样品的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算为所需单位。
- 无模板对照NTC和阴性质控NCS的检测结果应大于标准曲线最低浓度样品的Ct值。
- 若ERC的回收率在50%-150%之外，而SRC的回收率在50%-150%之内，可能是样本中存在干扰，影响ERC的回收率。
