K2-HCD05 毕赤酵母宿主细胞残留DNA检测试剂盒 （qPCR-荧光探针法）
试剂盒简介
毕赤酵母宿主细胞残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的毕赤酵母宿主细胞残留DNA含量的专用试剂盒。本试剂盒利用探针法荧光定量PCR原理，定量检测样品中毕赤酵母宿主细胞残留DNA含量。专一性强、检测快速、性能稳定，最低检测限可以达到fg水平。
本试剂盒配套的毕赤酵母DNA定量参考品，可准确定量样品中毕赤酵母残留DNA。
试剂盒组分
规格：50 Reactions、100 Reactions
表1 试剂盒组分
|
组分 |
组分编号 |
50 Reactions |
100 Reactions |
储存条件 |
|
毕赤酵母qPCR Mix |
HCD05-A |
700 μL |
700 μL×2管 |
-20℃及以下 |
|
毕赤酵母Primer&Probe Mix |
HCD05-B |
110 μL |
220 μL |
-20℃及以下，避光 |
|
毕赤酵母DNA定量参考品（30 ng/μL） |
HCD05-C |
25 μL |
50 μL |
-20℃及以下 |
|
DNA稀释液 |
HCD05-D |
1.2 mL×2管 |
1.2 mL×4管 |
-20℃及以下 |
注：本试剂盒中不含ROX参比染料，如您所用仪器需要添加ROX参比染料，需单独购买。
有效期
规定储存条件下2年，具体详见试剂盒标签。
适用机型（包括但不限于）
Thermo Scientific：ABI 7500、QuantStudio™ 5、ABI StepOnePlus
Bio-Rad：CFX96
上海宏石：SLAN-96S
所需器材
仪器：移液器、漩涡混匀仪、瞬时离心机、qPCR仪
材料：EP管、PCR管、八联管、移液吸头等
注意事项
- 检测之前请仔细阅读本说明书，按照说明书内容进行规范操作。
- 每个组分使用前请振荡混匀并瞬时离心至管底。
- 加样和配液过程请在超净台中分区进行。
- 试剂使用结束后尽快放置推荐的储存条件下，避免在常温或高温条件下存放时间过长。
- 所用EP管、PCR管、吸头等耗材需无菌、无核酸酶。
操作过程
- 毕赤酵母DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备
毕赤酵母DNA定量参考品的浓度标注于管壁标签，请确认后再进行稀释。
以毕赤酵母DNA定量参考品30 ng/μL为初始浓度，用DNA稀释液将参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。具体操作如下：
1.1 将试剂盒中的DNA定量参考品和DNA稀释液置于低温或室温下融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 sec，重复2-3次确保充分混匀。
1.2 取6支洁净的1.5 mLEP管，分别标记为3 ng/μL，ST①，ST②，ST③，ST④，ST⑤。
1.3 在标记为3 ng/μL的EP管中加入90 μL DNA稀释液和10 μL DNA定量参考品（30 ng/μL），即稀释为3 ng/μL，瞬时振荡混匀后快速离心3-5 sec，重复2-3次确保定量参考品与DNA稀释液充分混匀。
1.4 在ST①，ST②，ST③，ST④，ST⑤管中先分别加入90 μL DNA稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下：
表2 毕赤酵母DNA定量参考品的稀释
|
稀释管 |
稀释比例 |
终浓度 |
|
ST① |
10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA稀释液 |
300 pg/μL |
|
ST② |
10 μL ST①+90 μL DNA稀释液 |
30 pg/μL |
|
ST③ |
10 μL ST②+90 μL DNA稀释液 |
3 pg/μL |
|
ST④ |
10 μL ST③+90 μL DNA DNA稀释液 |
300 fg/μL |
|
ST⑤ |
10 μL ST④+90 μL DNA稀释液 |
30 fg/μL |
注:
- 初次使用时建议将DNA定量参考品分装储存，减少反复冻融次数和避免污染。
- 标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，如需要可适当扩大或缩小线性范围。
- 每个梯度稀释时需轻微振荡并瞬时离心后再吸取，确保模板完全混匀。
- 使用带滤芯的吸头，并每次更换吸头，注意规范操作，避免管与管直接的交叉污染。
- 不同对照样品的制备
2.1 样品加标回收质控ERC（Extraction Recovery Control）的制备
根据需要设ERC中的毕赤酵母DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL的毕赤酵母DNA样品为例）。具体操作如下：
- 取50 μL待测样品（Test Sample，TS）加入1.5 mL洁净的EP管中，再加入50 μL ST③，混匀，标记为加标回收ERC；
- 加标回收ERC和同批待测样品一起进行样品前处理，制备加标回收ERC纯化液。
2.2 标准品回收质控SRC（Standards Recovery Control，SRC）的制备（可选）
根据需要设SRC中的毕赤酵母DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL的毕赤酵母 DNA样品为例），具体操作如下：
- 取100 μL ST③加入1.5 mL洁净的EP管中，标记为标准品回收SRC；
- 标准品回收SRC和同批待测样品一起进行样品前处理，制备标准品回收SRC纯化液。
2.3 阴性质控NCS的制备
根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
- 取100 μL样品回收溶液（或DNA稀释液）加入1.5 mL洁净的EP管中，标记为阴性质控NCS；
- 阴性质控NCS和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。
2.4 无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC，无模板对照NTC无需进行样品前处理，在qPCR反应液的制备和加样阶段开始配制即可。
- qPCR反应液的制备和加样
3.1 根据所要检测的标准曲线和待测样品数量，计算所需反应孔数，每个样品通常需做3个重复孔。
反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线 + 1个阴性质控NCS + 1个无模板对照NTC + n个样品加标回收质控ERC + n个待测样品 + 标准品回收质控SRC（可选））× 3
通常推荐每个待测样品都需要做ERC，如几个待测样品为同一产品，可只做一个。
3.2 根据反应孔数，将除模板外的组分混合成Mix反应液，各试剂置于低温或室温融化，轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 sec，重复2-3次确保充分混匀，加样。
Mix反应液=（反应孔数+2）×13 μL毕赤酵母qPCR Mix +（反应孔数+2）×2 μL毕赤酵母Primer&Probe Mix（含有2孔的损失量，如检测样本较多，可适当增加）。
表3反应体系
|
组分 |
体积 |
|
毕赤酵母qPCR Mix |
13 μL |
|
毕赤酵母Primer&Probe Mix |
2 μL |
|
DNA template |
10 μL |
|
Total |
25 μL |
3.3 将配制的Mix反应液轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 sec，重复2-3次确保充分混匀，分装，加入DNA模板。加样完成后密封好管子，低速离心后混匀再低速离心，完全混匀反应液，如有气泡，需将气泡排尽。
下表为96孔板排位示例
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
NTC |
|
|
|
|
|
S1 ERC |
S1 ERC |
S1 ERC |
S1 |
S1 |
S1 |
|
B |
NTC |
|
ST① |
ST① |
ST① |
|
S2 ERC |
S2 ERC |
S2 ERC |
S2 |
S2 |
S2 |
|
C |
NTC |
|
ST② |
ST② |
ST② |
|
S3 ERC |
S3 ERC |
S3 ERC |
S3 |
S3 |
S3 |
|
D |
|
|
ST③ |
ST③ |
ST③ |
|
S4 ERC |
S4 ERC |
S4 ERC |
S4 |
S4 |
S4 |
|
E |
NCS |
|
ST④ |
ST④ |
ST④ |
|
S5 ERC |
S5 ERC |
S5 ERC |
S5 |
S5 |
S5 |
|
F |
NCS |
|
ST⑤ |
ST⑤ |
ST⑤ |
|
|
|
|
|
|
|
|
G |
NCS |
|
|
|
|
|
SRC |
SRC |
SRC |
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
注: 该示例展示的是用本试剂盒检测5个样品的毕赤酵母 DNA残留量
包括：5个浓度梯度的毕赤酵母DNA标准曲线（ST① - ST⑤）、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、5个样品加标回收质控ERC、5个待测样品S、1个标准品回收质控SRC。每个样本至少做3个重复孔。
- 扩增程序参数设置
在荧光定量PCR仪器上进行扩增程序设置：设置反应体积25 μL，FAM通道。
|
循环步骤 |
温度（℃） |
时间 |
循环数 |
|
预变性 |
95 ℃ |
5 min |
1 |
|
变性 退火/延伸（收集荧光） |
95 ℃ 60 ℃ |
20 sec 30 sec |
40 |
以ABI 7500 v2.3为例
- 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。在Experiment Properties界面选择7500（96 Wells）、Quantitation-Standard Curve、TaqMan Reagents。
- 在Plate Setup界面设置检测探针和样本。在“Define Targets and Samples”面板中创建1个检测探针（Define Targets），命名为“毕赤酵母DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，淬灭基团为“none”；创建样本（Define Samples），ST① - ST⑤、NTC、NCS、ERC、S、SRC。
- 在“Assign Targets and Samples”面板中，将标准曲线的“Task”一栏设置为“Standard”（
），并在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（即每孔加入的参考品浓度，单位为fg/μL），对应样本（Sample）一栏选择“ST①”、“ST②”、“ST③”、“ST④”、“ST⑤”；无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“Negative Control”（
），对应样本（Sample）一栏选择“NTC”；将阴性质控NCS孔、样品加标回收质控ERC孔、待测样品孔和标准品回收质控SRC孔（可选）的“Task”一栏设置为“Unknown”（
），对应样本（Sample）一栏选择“NCS”、“ERC”、“S”和“SRC”。 - 在“Run Method”面板中，按扩增程序参数设置反应程序，反应体积为25 μL。
- 点击右上角的“START”开始程序。
- 结果分析
以ABI 7500 v2.3为例
进入Analysis板块
- 在Amplification Plot界面中，系统会自动给出Threshold，可根据需要手动调节Threshold至合适位置，结束后点击“Analyze”。可以在“Multiple Plots View”查看扩增曲线形态是否正常，如果三个复孔中其中一个差异较大，可舍去。
- 在Standard Curve界面中，读取标准曲线的R2、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Y-Inter）等。
正常的标曲：R2>0.99；扩增效率在90%-110%之间。
- 在右边的“View Well Table”面板中，“Quantity”一栏中可以读取不同样品的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算为所需单位。
- 无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35.00，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。
- 阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct均值。
- 若ERC的回收率在50%-150%之外，而SRC的回收率在50%-150%之内，可能是样本中存在干扰，影响ERC的回收率。
