Vero宿主细胞残留DNA检测试剂盒(qPCR-荧光探针法)
使用说明书
试剂盒简介
Vero残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的Vero残留DNA含量的专用试剂盒。本试剂盒利用探针法荧光定量PCR原理,定量检测样品中Vero残留DNA含量。专一性强、检测快速、性能稳定,最低检测限可以达到fg水平。
本试剂盒配套的Vero DNA定量参考品,已溯源至国家标准品,可准确定量样品中Vero残留DNA。
试剂盒组分
规格:50 Reactions、100 Reactions
组分 |
组分编号 |
50 Reactions |
100 Reactions |
储存条件 |
Vero qPCR Mix |
HCD03-A |
700 μL |
700 μL×2管 |
-20 ℃及以下 |
Vero Primer&Probe Mix |
HCD03-B |
110 μL |
220 μL |
-20 ℃及以下,避光 |
Vero DNA定量参考品(30 ng/μL) |
HCD03-C |
25 μL |
50 μL |
-20 ℃及以下 |
DNA稀释液 |
HCD03-D |
1.2 mL×2管 |
1.2 mL×4管 |
-20 ℃及以下 |
【说明】
本试剂盒中不含ROX参比染料,如您所用仪器需要添加ROX参比染料,需单独购买。
有效期
规定储存条件下24个月,具体详见试剂盒标签。
适用机型(包括但不限于)
Thermo Scientific:ABI 7500、QuantStudio™ 5
Bio-Rad:CFX96
上海宏石:SLAN-96S
注意事项
1.检测之前请仔细阅读本说明书,按照说明书内容进行规范操作。
2.每个组分均在冰上或低温下融化,避免温度过高,使用前请振荡混匀并瞬时离心至管底。
3.加样和配液过程请在超净台中分区进行,避免时间过长,如时间较长请尽量在冰上进行。
4.试剂使用结束后尽快放置推荐的储存条件下,避免在常温或高温条件下存放时间过长。
5.所用Ep管、PCR管、枪头等耗材需无菌、无核酸酶。
操作过程
1.Vero DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备
Vero DNA定量参考品的浓度标注于管壁标签,请确认后再进行稀释。
以Vero DNA定量参考品30 ng/μL为初始浓度,用DNA稀释液将参考品进行梯度稀释,稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL。具体操作如下:
1.将试剂盒中的DNA定量参考品和DNA稀释液置于冰上或2-8℃条件下融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,瞬时离心3-5 sec。
2.取7支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为3 ng/μL,ST①,ST②,ST③,ST④,ST⑤,ST⑥。
3.在标记为3 ng/μL的离心管中加入90 μL DNA稀释液和10 μL DNA定量参考品(30 ng/μL),即稀释为3 ng/μL,瞬时振荡混匀后快速离心3-5 sec,重复2-3次确保定量参考品与DNA稀释液充分混匀。该浓度可分装置于-20 ℃及以下温度短期保存(不超过1个月),使用时避免反复冻融。
4.在ST①,ST②,ST③,ST④,ST⑤,ST⑥管中先分别加入90 μL DNA稀释液,再进行梯度稀释,稀释方法如下:
稀释管 |
稀释比例 |
终浓度 |
ST① |
10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA稀释液 |
300 pg/μL |
ST② |
10 μL ST①+90 μL DNA稀释液 |
30 pg/μL |
ST③ |
10 μL ST②+90 μL DNA稀释液 |
3 pg/μL |
ST④ |
10 μL ST③+90 μL DNA DNA稀释液 |
300 fg/μL |
ST⑤ |
10 μL ST④+90 μL DNA稀释液 |
30 fg/μL |
ST⑥ |
10 μL ST⑤+90 μL DNA稀释液 |
3 fg/μL |
【说明】
1.已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8 ℃,如长时间不用,请放置于-20 ℃。
2.初次使用时将DNA定量参考品分装储存,减少反复冻融次数和避免污染。
3.标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择,如需要,而可用适当扩大或缩小线性范围。
4.每个梯度稀释时需轻微振荡并瞬时离心后再吸取,确保模板完全混匀。
5.使用带滤芯的枪头,并每次更换枪头,注意规范操作,避免管与管直接的交叉污染。
1.不同对照样品的制备
1.样品加标回收质控ERC(Extraction Recovery Control)的制备
根据需要设ERC中的Vero DNA标准品浓度(以制备加3 pg/μL的Vero DNA样品为例)。具体操作如下:
(1)取50 μL待测样品(Test Sample,TS)加入1.5 mL洁净的离心管中,再加入50 μL ST③,混匀,标记为加标回收ERC;
(2)加标回收ERC和同批待测样品一起进行样品前处理,制备加标回收ERC纯化液。
1.标准品回收质控SRC(Standards Recovery Control,SRC)的制备(可选)
根据需要设SRC中的Vero DNA 标准品浓度(以制备加3 pg/μL的Vero DNA样品为例),具体操作如下:
1.取100 μL ST③加入1.5 mL洁净的离心管中,标记为标准品回收SRC;
2.标准品回收SRC和同批待测样品一起进行样品前处理,制备标准品回收SRC纯化液。
1.阴性质控NCS的制备
根据实验设置阴性质控,具体操作如下:
(1)取100 μL样品回收溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL洁净的离心管中,标记为阴性质控NCS;
(2)阴性质控NCS和同批待测样品一起进行样品前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。
1.无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC,无模板对照NTC无需进行样品前处理,在qPCR反应液的制备和加样阶段开始配制即可。
1.qPCR反应液的制备和加样
A.根据所要检测的标准曲线和待测样品数量,计算所需反应孔数,每个样品通常需做3个重复孔。
反应孔数=(6个浓度梯度的标准曲线 + 1个阴性质控NCS + 1个无模板对照NTC + n个样品加标回收质控ERC + n个待测样品 + 标准品回收质控SRC(可选))× 3
通常推荐每个待测样品都需要做ERC,如几个待测样品为同一产品,可只做一个。
A.根据反应孔数,将除模板外的组分混合成Mix反应液,各试剂置于冰上或低温下融化,轻微振荡混匀,加样。
Mix反应液=(反应孔数+2)×13 μL Vero qPCR Mix +(反应孔数+2)×2 μL Vero Primer&Probe Mix(含有2孔的损失量,如检测样本较多,可适当增加)
组分 |
体积 |
Vero qPCR Mix |
13 μL |
Vero Primer&Probe Mix |
2 μL |
DNA template |
10 μL |
Total |
25 μL |
A.将配制的Mix反应液充分混匀后,分装,加入DNA模板。加样完成后密封好管子,低速离心后混匀再低速离心,完全混匀反应液,如有气泡,需将气泡排尽。
下表为96孔板排位示例
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
A |
NTC |
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S1 ERC |
S1 ERC |
S1 ERC |
S1 |
S1 |
S1 |
B |
NTC |
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ST① |
ST① |
ST① |
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S2 ERC |
S2 ERC |
S2 ERC |
S2 |
S2 |
S2 |
C |
NTC |
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ST② |
ST② |
ST② |
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S3 ERC |
S3 ERC |
S3 ERC |
S3 |
S3 |
S3 |
D |
|
|
ST③ |
ST③ |
ST③ |
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S4 ERC |
S4 ERC |
S4 ERC |
S4 |
S4 |
S4 |
E |
NCS |
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ST④ |
ST④ |
ST④ |
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S5 ERC |
S5 ERC |
S5 ERC |
S5 |
S5 |
S5 |
F |
NCS |
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ST⑤ |
ST⑤ |
ST⑤ |
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G |
NCS |
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ST⑥ |
ST⑥ |
ST⑥ |
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SRC |
SRC |
SRC |
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|
H |
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【说明】
该示例展示的是用本试剂盒检测5个样品的Vero DNA残留量
包括:6个浓度梯度的Vero DNA标准曲线(ST① - ST⑥)、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、5个样品加标回收质控ERC、5个待测样品S、1个标准品回收质控SRC。每个样本至少做3个重复孔。
1.扩增程序参数设置
在荧光定量PCR仪器上进行扩增程序设置:设置反应体积25 μL,FAM通道。
循环步骤 |
温度(℃) |
时间 |
循环数 |
预变性 |
95 ℃ |
5 min |
1 |
变性 退火/延伸(收集荧光) |
95 ℃ 60 ℃ |
20 sec 30 sec |
40 |
以ABI 7500 v2.3为例
1.创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。在Experiment Properties界面选择7500(96 Wells)、Quantitation-Standard Curve、TaqMan Reagents
2.在Plate Setup界面设置检测探针和样本。在“Define Targets and Samples”面板中创建1个检测探针(Define Targets),命名为“Vero DNA”,选择报告荧光基团为“FAM”,淬灭基团为“none”;创建样本(Define Samples),ST① - ST⑥、NTC、NCS、ERC、S、SRC。
3.在“Assign Targets and Samples”面板中,将标准曲线的“Task”一栏设置为“Standard”(),并在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”、“3”(即每孔加入的参考品浓度,单位为fg/μL),对应样本(Sample)一栏选择“ST①”、“ST②”、“ST③”、“ST④”、“ST⑤”、“ST⑥”;无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“Negative Control”(),对应样本(Sample)一栏选择“NTC”;将阴性质控NCS孔、样品加标回收质控ERC孔、待测样品孔和标准品回收质控SRC孔(可选)的“Task”一栏设置为“Unknown”(),对应样本(Sample)一栏选择“NCS”、“ERC”、“S”和“SRC”。
4.在“Run Method”面板中,按扩增程序参数设置反应程序,反应体积为25 μL。
5.点击右上角的“START”开始程序。
1.结果分析
以ABI 7500 v2.3为例
进入Analysis板块
A.在Amplification Plot界面中,系统会自动给出Threshold,可根据需要手动调节Threshold至合适位置,结束后点击“Analyze”。可以在“Multiple Plots View”查看扩增曲线形态是否正常,如果三个复孔中其中一个差异较大,可舍去。
B.在Standard Curve界面中,读取标准曲线的R2、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Y-Inter)等。
正常的标曲:R2>0.99;扩增效率在90%-110%之间。
A.在右边的“View Well Table”面板中,“Quantity”一栏中可以读取不同样品的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算为所需单位。
B.无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35.00,或根据实验室自身验证结果设定具体标准。
C.阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct均值。
D.若ERC的回收率在50%-150%之外,而SRC的回收率在50%-150%之内,可能是样本中存在干扰,影响ERC的回收率。