首页 ꄲ 生物制品质量控制 ꄲ K2-HCD01 E.coli残留DNA检测试剂盒（qPCR-荧光探针法）

K2-HCD01 E.coli残留DNA检测试剂盒（qPCR-荧光探针法）

E.coli残留DNA检测试剂盒（qPCR-荧光探针法）

使用说明书

试剂盒简介

E.coli残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的E. coli残留DNA含量的专用试剂盒。本试剂盒利用探针法荧光定量PCR原理，定量检测样品中E. coli残留DNA含量。专一性强、检测快速、性能稳定，最低检测限可以达到fg水平。

本试剂盒配套的E. coli DNA定量参考品，已溯源至国家标准品，可准确定量样品中E. coli残留DNA。

试剂盒组分

试剂盒规格：100 Reactions

组分名称	组分编号	组分规格	储存条件
E. coli qPCR Mix	K2-HCD01-A	700 μL×2管	-20 ℃
E. coli Primer&Probe Mix	K2-HCD01-B	220 μL	-20 ℃，避光
E. coli DNA定量参考品（30 ng/μL）	K2-HCD01-C	50 μL	-20 ℃
DNA稀释液	K2-HCD01-D	1.2 mL×4管	-20 ℃

【说明】

1.试剂盒所有组分请于-20℃及以下保存，E. coli Primer&Probe Mix需避光。

2.本试剂盒中不含ROX参比染料，如您所用仪器需要添加ROX参比染料，需单独购买。

有效期

规定储存条件下18个月。

适用机型（包括但不限于）

Thermo Scientific：ABI 7500、QuantStudio™ 5

Bio-Rad：CFX96

上海宏石：SLAN-96S

注意事项

1.检测之前请仔细阅读本说明书，按照说明书内容进行规范操作。

2.每个组分均在冰上或低温下融化，避免温度过高，使用前请振荡混匀并瞬时离心至管底。

3.加样和配液过程请在超净台中分区进行，避免时间过长，如时间较长请尽量在冰上进行。

4.试剂使用结束后尽快放置推荐的储存条件下，避免在常温或高温条件下存放时间过长。

5.所用EP管、PCR管、枪头等耗材需无菌和无核酸酶。

操作过程

1.E. coli DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

E. coli DNA定量参考品的浓度标注于管壁标签，请确认后再进行稀释。

以E. coli DNA定量参考品30 ng/μL为初始浓度，用DNA稀释液将参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。具体操作如下：

A.将试剂盒中的DNA定量参考品和DNA稀释液置于冰上或2-8℃条件下融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 s。

B.取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为3 ng/μL，ST①，ST②，ST③，ST④，ST⑤。

C.在标记为3 ng/μL的离心管中加入90 μL DNA稀释液和10 μL DNA定量参考品（30 ng/μL），即稀释为3 ng/μL，瞬时振荡混匀后短时间快速离心3-5 s，重复2-3次确保定量参考品与DNA稀释液充分混匀。该浓度可分装置于-20℃及以下温度短期保存（不超过1个月），使用时避免反复冻融。

D.在ST①，ST②，ST③，ST④，ST⑤管中先分别加入90 μL DNA稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
ST①	10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA稀释液	300 pg/μL
ST②	10 μL ST①+90 μL DNA稀释液	30 pg/μL
ST③	10 μL ST②+90 μL DNA稀释液	3 pg/μL
ST④	10 μL ST③+90 μL DNA DNA稀释液	300 fg/μL
ST⑤	10 μL ST④+90 μL DNA稀释液	30 fg/μL

【说明】

（1）已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃，如长时间不用，请放置于-20℃。

1.初次使用时将DNA定量参考品分装储存，减少反复冻融次数和避免污染。

2.标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，如需要，而可用适当扩大或缩小线性范围。

3.每个梯度稀释时需轻微振荡并瞬时离心后再吸取，确保模板完全混匀。

4.使用带滤芯的枪头，并每次更换枪头，注意规范操作，避免管与管直接的交叉污染。

1.不同对照样品的制备

样品加标回收质控ERC（Extraction Recovery Control）的制备

根据需要设ERC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL的E.coli DNA样品为例）。具体操作如下：

A.取50 μL待测样品（Test Sample，TS）加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入50 μL ST③，混匀，标记为加标回收ERC；

B.加标回收ERC和同批待测样品一起进行样品前处理，制备加标回收ERC纯化液。

标准品回收质控SRC（Standards Recovery Control，SRC）的制备（可选）

根据需要设SRC中的E.coli DNA 标准品浓度（以制备加3 pg/μL的E.coli DNA样品为例），具体操作如下：

A.取100 μL ST③加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为标准品回收SRC；

B.标准品回收SRC和同批待测样品一起进行样品前处理，制备标准品回收SRC纯化液。

阴性质控NCS的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

A.取100 μL样品回收溶液（或DNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为阴性质控NCS；

B.阴性质控NCS和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，无模板对照NTC无需进行样品前处理，在qPCR反应液的制备和加样阶段开始配制即可。

1.qPCR反应液的制备和加样

A.根据所要检测的标准曲线和待测样品数量，计算所需反应孔数，每个样品通常需做3个重复孔。

反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线 + 1个阴性质控NCS + 1个无模板对照NTC + n个样品加标回

收质控ERC + n个待测样品 + 标准品回收质控SRC(可选)）× 3

【说明】通常推荐每个待测样品都需要做ERC，如几个待测样品为同一产品，可只做一个。

A.根据反应孔数，将除模板外的组分混合成Mix反应液，各试剂置于冰上或低温下融化，轻微振荡混匀，加样。

Mix反应液=（反应孔数+2）×13 μL E. coli qPCR Mix +（反应孔数+2）×2 μL E. coli Primer&Probe Mix（含有2孔的损失量，如检测样本较多，可适当增加）

组分	体积
E. coli qPCR Mix	13 μL
E. coli Primer&Probe Mix	2 μL
DNA template	10 μL
Total	25 μL

A.将配制的Mix反应液充分混匀后，分装，加入DNA模板。加样完成后密封好管子，低速离心后混匀再低速离心，完全混匀反应液，如有气泡，需将气泡排尽。

下表为96孔板排位示例

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

S1 ERC

S1

B

NTC

ST①

S2 ERC

S2

C

NTC

ST②

S3 ERC

S3

D

ST③

S4 ERC

S4

E

NCS

ST④

S5 ERC

S5

F

NCS

ST⑤

G

NCS

SRC

H

【说明】

该示例展示的是用本试剂盒检测5个样品的E. coli DNA残留量。包括：5个浓度梯度的E.coli DNA标准曲线（ST① - ST⑤）、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、5个样品加标回收质控ERC、5个待测样品、1个标准品回收质控SRC。每个样本至少做3个重复孔。

1.扩增程序参数设置

在荧光定量PCR仪器上进行扩增程序设置：设置反应体积25 μL，FAM通道。

循环步骤

温度（℃）

时间

循环数

预变性

95℃

5 min

1

变性

退火/延伸（收集荧光）

95℃

60℃

20 sec

30 sec

40

以ABI 7500 v2.3为例

A.创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。在Experiment Properties界面选择7500（96 Wells）、Quantitation-Standard Curve、TaqMan Reagents

B.在Plate Setup界面设置检测探针和样本。在“Define Targets and Samples”面板中创建1个检测探针（Define Targets），命名为“E.coli DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，淬灭基团为“none”；创建样本（Define Samples），ST① - ST⑤、NTC、NCS、ERC、S、SRC。

C.在“Assign Targets and Samples”面板中，将标准曲线的“Task”一栏设置为“Standard”（），并在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（即每孔加入的参考品浓度，单位为fg/μL），对应样本（Sample）一栏选择“ST①”、“ST②”、“ST③”、“ST④”、“ST⑤”；无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“Negative Control”（），对应样本（Sample）一栏选择“NTC”；将阴性质控NCS孔、样品加标回收质控ERC孔、待测样品孔和标准品回收质控SRC孔（可选）的“Task”一栏设置为“Unknown”（），对应样本（Sample）一栏选择“NCS”、“ERC”、“S”和“SRC”。