通用型磁珠法宿主残留 DNA 样本前处理试剂盒
使用说明书
1.试剂盒简介
本试剂盒适用于生物制品样本中宿主残留 DNA 检测的前处理。采用磁珠法 DNA 提取原理,可最大限度的分离纯化样本中的宿主残留 DNA,实现从不同复杂基质中回收微量 DNA 样本。采用高吸附的磁珠和优化的缓冲体系,可高效稳定地提取样本中的微量宿主细胞残留 DNA。
该前处理试剂盒可与本公司的多种宿主细胞残留 DNA 检测试剂盒(qPCR 法)配套使用,包括E.coli 残留 DNA 检测试剂盒(Cat#K2-HCD01)、CHO 宿主细胞残留 DNA 检测试剂盒 (Cat#K2-HCD02)和 Vero 宿主细胞残留 DNA 检测试剂盒(Cat#K2-HCD03)等。
2.试剂盒组分
规格:25 Extracts /100 Extracts
注:洗涤液 A*在使用前需加入9 mL(25 Extracts)或36 mL(100 Extracts)乙醇,洗涤液 B*在使用前需加入12 mL(25 Extracts)或48 mL(100 Extracts)乙醇,并做好标记;试剂在使用前需充分混匀;使用后将瓶盖盖紧,以防止乙醇挥发。如长期保存可将磁珠悬浮液置于4℃,确保磁珠的结合活性。
3.有效期
规定储存条件下12 个月,具体详见试剂盒标签。
4.运输条件
组分I 室温运输,室温保存;组分II 冰袋或干冰运输,-20℃保存。
5.注意事项
1. 检测之前请仔细阅读本说明书,按照说明书内容进行规范操作,样本处理建议在超净台或生物安全柜中进行。
2. 使用该试剂盒前,注意观察常温保存溶液是否有析出或者沉淀,若溶液发生沉淀,放置于37℃水浴中,以溶解沉淀。试剂使用前请振荡混匀并瞬时离心至管底。
3. 吸取样本时应尽量避免吸入磁珠,磁珠易沉淀使用前请振荡混匀。
4. 试剂使用结束后尽快放置推荐的储存条件下,避免在常温或高温条件下存放时间过长。
5. 所用Ep管、枪头等耗材需无菌、无核酸酶。
6.实验所需但试剂盒中未含材料
· 10 μL、100 μL、1000 μL 不等的低吸附带滤芯枪头
· 1.5 mL 低吸附离心管
· 无水乙醇(分析纯)
· 1×PBS 缓冲液(pH 7.4,无 Mg 2+和 Ca 2+离子),无菌,无核酸酶
· 超纯水
7.实验所需但试剂盒中未含设备
· 漩涡振荡器
· 水浴锅或金属浴
· 瞬时离心机
· 磁力架
· 10 μL、100 μL、1000 μL 移液枪
· 超净台或生物安全柜
8.提取操作过程
1. 样本制备
1.1 待测样本为疫苗等本身含有较高的 DNA 含量的样本,为了保证检测的准确性,使样品的检测值在标准曲线线性范围之内,可用 1×PBS(pH7.4,无 Mg 2+和 Ca 2+离子)对样本进行适当比例稀释后提取,样本稀释后,以空白基质稀释液作为阴性样本。
1.2 待测样本为干粉的,可用超纯水或 1×PBS 将样本稀释成 10 mg/mL 或者 100 mg/mL 后使用。
1.3 待测样本为复杂背景基质的,可根据需要进行加标回收实验,以确定合适的样本稀释倍数。
1.4 一般情况下生物制品纯化过程中间样品的 pH 值均为中性,若样品的 pH<5 或者 pH>9,则会影响样品纯化处理效果。若样品的 pH 值不为中性,可用 1M 的盐酸或氢氧化钠调整样品的 pH 至中性后(pH 6.0~8.0)再进行纯化操作。
1.5 为了确保结果的准确性,每个待测样本建议至少进行 2 次 DNA 提取处理。
1.6 每次实验中需要设置一个阴性样本 NCS,与其余样本一起处理,以检验样本处理过程中是否存在污染。
1.7 用加标回收样本(ERC)来评估 DNA 提取的回收率和准确度,并可用 ERC 来评估验证分析方法和系统性能。对具体样品的 DNA 加标量设定在其无加标测试值的 2-10 倍为宜(可参考相应的宿主细胞残留 DNA 检测试剂盒)。
2. 蛋白酶 K 处理
2.1 将 100 µL 的样本,阴性样本和加标回收样本加入 1.5 mL 的离心管中;
2.2 每管加入 100 μL 蛋白酶 K 反应液和 10 µL 蛋白酶 K,涡旋充分混匀;
【注】:样本蛋白浓度 0-100 mg/mL,蛋白酶 K 用量为 10 μL;样本蛋白浓度 100-200 mg/mL,蛋白酶 K 用量为 20 μL。
2.3 60℃孵育 20 min,室温放置 3-5 分钟。
3. 核酸-磁珠结合
3.1 加入 400 μL 结合液、9 μL 糖原和 6 μL 核酸助沉剂,涡旋混匀 3-5 s 后,瞬时离心 5-10 s;
3.2 在样品混合物中加入 20 μL 磁珠,漩涡混匀后放置 10 min,每隔 2-3 min 涡旋混匀 3-5 s;
【注】:磁珠使用前应在漩涡振荡器充分振荡 5 s;如果样品较多,每次加入磁珠过程中应再次充分震荡混匀磁珠,以保证每次加入的磁珠量的一致性。
3.3 短暂离心收集悬液至管底,然后将离心管置于磁力架上,室温静置至溶液澄清(等待磁珠完全分离的时间约为 1-2 min);
3.4 保持离心管于磁力架上,避免震动,用 1 mL 移液器小心吸去大部分溶液;
【注】:去除上清时枪头避免搅动磁珠,避免磁珠同上清一起被去除。
3.5 继续保持离心管于磁力架上 1 min,用 200 µL 移液器吸去残余上清。
4. 洗涤
4.1 加入 500 μL 洗涤液 A(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),涡旋混匀,确保磁珠分散,离心管壁无聚集磁珠;
4.2 瞬时离心后将离心管重置于磁性分离架上,待溶液澄清,磁珠完全分离后,用枪头移去上清液,完成第 1 次磁珠洗涤;
4.3 加入 500 μL 洗涤液 B(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),涡旋混匀,确保磁珠分散,离心管壁无聚集磁珠;
4.4 瞬时离心后将离心管重置于磁性分离架上,待溶液澄清,磁珠完全分离后,用枪头移去上清液,完成第 2 次磁珠洗涤;
4.5 为保证液体充分移除,可将离心管再次瞬时离心 10 s,置于磁性分离架上,待磁珠完全分离后,用 10 μL 枪头小心地将残余液体吸除干净。
4.6 打开管盖,室温放置 3-5 min 直至乙醇完全挥发。肉眼观察到磁珠表面无反光或出现裂隙即表明乙醇已挥发完全。
【注】:避免磁珠过分干燥,导致磁珠粘在管壁上降低回收率。
5. 洗脱
5.1 将离心管放入常规离心管架,沿离心管壁加入 50-100 μL 65℃预热的洗脱液,用漩涡振荡器轻微振荡 5 s 使磁珠和洗脱液混匀,65℃水浴 5-10 min,水浴过程中可再次振荡混匀 2-3 次;
【注】:振荡后需将残留于管壁上的磁珠和洗脱液轻甩至管底,振荡至管盖上的磁珠和洗脱液需快速离心后重新震荡混匀。
5.2 孵育后瞬时离心,将离心管盖上吸附的液体收集到底部后,将离心管置于磁力架上静置 2 min,等待样本温度恢复到室温水平,磁珠成团贴壁,液体变清澈;
5.3 将 DNA 溶液移至新的 1.5 mL 离心管中,随即进行样本检测。短期保存于-20℃,长期保存需放置于-80℃。
【注】:收集洗脱液时,应将离心管内溶液转移完全,离心管内不得残留液体,否则将影响样品检测的准确性。
9.操作注意细节
· 在磁珠洗涤或洗脱过程中,每次震荡混匀后都要用瞬时离心机短暂离心,以保证没有磁珠液附着在离心管管盖和管壁上;
· 磁珠的干燥时间依具体情况而定,室温较高或空气干燥的环境下可以选择较短干燥时间;而室温较低或空气湿润环境下,干燥时间可以稍长;
· 在去除乙醇干燥时,观察磁珠状态,勿让磁珠太干,以免洗脱不完全;
· 尽量在完成样品前处理纯化后就立即进行后续 DNA 检测,以保证检测结果的准确性。