K03-REK 重组肠激酶酶联免疫吸附测定试剂盒

 

重组肠激酶酶联免疫吸附测定试剂盒

使用说明书 

（96T）

使用前请仔细阅读说明书（注意事项），避免浪费您的时间和成本。

 

试剂盒用途

该试剂盒用于体外定量检测重组肠激酶含量。本试剂盒仅供研究或工业生产用。

 

试剂盒基本参数

检测范围：0.25 -16 ng/mL

特异性：可检测重组肠激酶，与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。

重复性：板内，板间变异系数均 < 10%。

工作时间：熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。

有效期：6个月

 

试剂盒检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测样品中的重组肠激酶含量。以抗重组肠激酶单克隆抗体包被酶标板，样品或标准品中的重组肠激酶与包被抗体结合，另一辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗重组肠激酶单克隆抗体与上述抗原-抗体复合物结合，以TMB为显色体系，在450 nm波长（参考波长650 nm）处测OD_{450/650 nm}值，重组肠激酶浓度与 OD_{450/650 nm} 值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中重组肠激酶的浓度。

 

试剂盒组成及保存

客户收到试剂盒后应立即按照下表中的条件分别保存各组分。

将酶标板、标记抗体（A2）和TMB底物(A3)置于-20±5℃保存。

 

中文名称	规格	储存条件
抗体包被的ELISA酶标板（96孔可拆卸)	8孔×12条	-20±5℃
冻干标准品（16 ng/支）(A1)	4支	2-8℃
浓缩辣根过氧化物酶化抗体 (A2)	1支×0.05 mL	-20±5℃
标准品&样品& HRP-抗体稀释液（25 X）(P1)	1瓶× 5 mL	2-8℃
浓缩洗涤液（25 X）(P2)	1瓶×40 mL	2-8℃
显色底物（TMB）(A3)	5支×0.125 mL	-20±5℃ 避光
底物稀释液（TMB）(P3)	1瓶×15 mL	2-8℃ 避光
反应终止液 (P4)	1瓶×5 mL	2-8℃
封板覆膜（可重复使用）	5张
产品说明书	1份
质检报告	1份

说明:

1. 所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。
2. 酶标板开封后未使用的剩余板条应封紧密封袋置于-20±5℃保存。
3. 酶标抗体（A2）始终置于-20±5℃储存。

 

试验所需自备物品

1. 酶标仪（主波长滤光片450 nm，参考波长滤光片在620-650 nm范围内均可）
2. 洗板机（非必需）
3. 高精度移液器（单道和8道排枪），EP管、一次性吸头及洁净试管
4. 恒温孵育器（37±2℃），纯化水
5. 洁净吸水纸，洁净加样槽

 

待测样品注意事项

1. 样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20±5℃（1个月内检测），或 -70℃以下（3个月内检测），避免反复冻融。未知样品应先离心取上清液进行上样操作，混悬液等样品影响测定结果。以上建议需根据样品实际情况酌情处理。
2. 试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释后再测。
3. 若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液或自有稀释溶液，可能由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
4. 样品基质的不同（如pH值、离子强度、蛋白酶活性等）可能影响样品的回收率，需根据实际情况对检测样品进行稀释或灭活处理。

 

检测前准备工作

HRP 标记抗体及酶标板板条应始终置于-20±5℃保存，无需室温平衡，随用随取。

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温。提前15分钟打开酶标仪预热。
2. 稀释液配制

将浓缩标准品 & 样品稀释液 或 浓缩HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释（1:24）。

3. 洗涤液配制

将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1:24）。   

提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液温度应为室温）。请当日使用。

4. 标准品配制

将标准品于1000转/分离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置1-2分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为16 ng/mL）, 然后进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。使用者可以根据实验需要稀释所需的浓度梯度配置。建议配制成以下浓度: 16、8、4、2、1、0.5、0.25 ng/mL。样品稀释液直接作为空白孔0 ng/mL。

倍比稀释方法

取7只EP管，每管中加入500 μL标准品&样品稀释液，从16 ng/mL的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL样品稀释液的EP管中混匀配成8 ng/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。

标准品稀释图例（以500 μL为例）

5. HRP标记抗体工作液配制

HRP标记抗体应始终置于-20±5℃保存，请勿室温平衡，随用随取。实验前请先将抗体管低速离心，以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量（以100 μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前3-5分钟，用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度（抗体：稀释液 = 1:250），现配现用。

6. TMB显色工作液配制

实验前计算实验所需用量（以100 μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟平衡底物和缓冲液，加样前底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度（底物：稀释液 =1:20），现用现配。

注：底物加入显色缓冲液混匀后，若观察显色液变蓝切勿加样，说明可能有污染，请更换洁净器皿。

 

洗涤方法

1. 自动洗板机：每孔加入洗涤液300 μL， 注入和吸出间隔180秒。
2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净厚吸水纸（或干布）上拍干，每孔加入洗涤液300 μL（此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗），浸泡3分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。

提示：若使用排枪，加样槽请不要与其他试剂混用，避免污染。

 

操作步骤

 

 

详细操作步骤：

1. 将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔100 μL，若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。

提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。浓度由低到高依次加入。

2. 洗涤：弃去液体，甩干，在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液300 μL，浸泡3分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。
3. 每孔中加入HRP-抗体工作液100 μL，混匀，酶标板覆膜并置于37℃孵育30分钟。
4. 洗涤：用洗涤液洗板5-7次，每次洗涤3分钟。
5. 每孔加底物显色工作液（TMB）100 μL，酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育10分钟。

提示：

1）推荐使用排枪及加样槽加入显色液及终止液，尽量缩小由于加样时差造成的显色差异。

2）根据实际显色情况酌情缩短或延长，显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

6.每孔加终止液50 μL，终止反应，建议在终止反应1-2分钟内尽快读数。

提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头切不要接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。

7.用酶标仪在450 nm波长（参考波长650 nm）测量各孔的光密度（OD_{450/650 nm}值）。

提示: 请提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置检测程序。

 

结果判断

1. 计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），绘出标准曲线（作图时亦可去掉空白组的值）。
2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（请使用Logistic四参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线）等，仅供参考。
3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测。
4. 若标准曲线R²值< 0.990，应当重新测定。
5. 典型数据

由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

X-浓度（ng /mL）	Y-OD450/650 nm
16	1.613
8	1.300
4	0.955
2	0.609
1	0.342
0.5	0.195
0.25	0.134
0	0.069

 

 

 

 

 

 

 

 

注意事项

1. 储存：试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染，否则可能会出现错误的结果。如近期不计划使用试剂盒，可将试剂盒整体放置于-20±5℃存放，待使用前将试剂盒内缓冲液平衡溶解即可。
2. 酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋，按推荐温度存放。
3. 加样：加样和加同一试剂时，第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间，从而明显的影响到测量值的准确性及重复性，每次的加样时间最好控制在10分钟之内。推荐设置复孔。
4. 温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜，洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。
5. 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。在读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。
6. 试剂配制：试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用1000转/分离心一分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打4-5次，使溶液混匀。所有试剂请按说明书指示精确配制。
7. 显色时间的控制：加入底物后，请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔五分钟），如梯度已经很明显，请提前加终止液终止反应，以避免颜色过深，影响酶标仪读数。
8. 底物：请避光保存底物。在储存和温育时，避免强光直接照射。
9. 混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器，使用最低频率，如无微量振荡器，可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

提示：不同批号的试剂盒组分不能混用（洗涤液和终止液除外）。

10. 关于样品回收率

1）本试剂盒以测定重组肠激酶的抗原性而非活力来推测蛋白残留量，因此试剂盒中标准品采用重组肠激酶的消光系数（E1%1 cm=20.01 D, 即当A280 nm=2.01时，牛肠激酶浓度为1 mg/mL）来计算其蛋白含量，并采用内部质控以最大限度保持标准品含量的精确和恒定。

2）不同计量方法以及产品纯度的差别可以导致不同来源、不同批次产品中牛肠激酶的蛋白含量不完全一致，也会造成回收率的差异。

3)为避免上述因素影响，建议将用作回收率测试的样品采用分光光度法（A280 nm）估算蛋白含量，再稀释至适合的浓度用于回收率测试，尽量减少回收率的误差。

11. 数据分析：

1）由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等）等原因可能导致，复孔间平

行度差异较大。建议在合理的取值范围内，以复孔读数的平均值为计算数值。

2. 酶标仪差异分析：酶标仪具有450nm和650nm滤光片，可直接设置主/参波长进行读数；若酶标仪只具有450nm 滤光片，亦可直接读数计算，但整体显色数值会偏高0.05-0.10范围内，620-650nm范围内不同参考波长读数差异可忽略不计，不影响标准曲线构建和样品浓度计算。
3. 由于实验条件和操作习惯的差异性，可能会引起显色液轻微污染 或 本底偏高的现象。建议酶标仪设置

选项直接设置：OD值减去空白孔的OD值作为矫正值，再行构建标准曲线和计算样品浓度。

12. 运输与存放

本实验室测试数据表明：冰袋运输条件下，试剂盒整体存放7天（货架时间）内不影响试剂盒性能。

 

 

 

【安全与环境注意事项】

1. 本试剂盒部分组分中含有酸性、碱性或防腐剂等成分，操作者应避免接触到皮肤或黏膜、或吞咽等。终止液具有一定的腐蚀性，应避免进入眼睛、接触皮肤或黏膜，一旦发生应立即用大量清水冲洗并酌情就医。
2. 实验操作中所有样品和样品有关的材料携带活性病毒微生物的应遵循国家相关法律法规要求，避免污染环境并妥善处理废弃物。

 

问题分析

若实验结果有问题，请及时对显色结果拍照，并妥善保存未使用板条及试剂，然后联系技术支持。也可参考以下信息以找出原因。

问题描述	可能原因	相应对策
标准曲线梯度差	吸液或加液不准	检查移液器和吸头
	标准品稀释不正确	溶解标准品时稍微旋转瓶身，轻轻混匀使粉末完全溶解
	酶标板洗涤不完全	保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量
显色很弱或无色	温育时间太短	保证充足的温育时间
	实验温度不正确	使用推荐的实验温度
	试剂体积不够或漏加	检查吸液及加液过程，保证所有试剂按顺序足量添加
	稀释不正确
读数数值低	酶标仪设置不正确	在酶标仪上检查波长和滤光片装置
		提前打开酶标仪预热
变异系数大	加液不正确	检查加液情况
背景值高	检测抗体的工作浓度过高	使用推荐的稀释倍数
	酶标板洗涤不完全	重新仔细阅读操作步骤，保证每步清洗完全;如果用自动洗板机，请检查所有的出口是否有堵塞;是否使用试剂盒配备的洗涤液。
	洗液有污染	配制新鲜的洗液
灵敏度低	ELISA试剂盒保存不当	按说明书要求保存相关试剂
	读数前未终止	OD读数前应在每孔中加入终止液