K07-PT 胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒

 

胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒

使用说明书

（96T）

使用前请仔细阅读说明书（注意事项），避免浪费您的时间和成本。

 

 

试剂盒用途

本试剂盒用于体外定量检测胰蛋白酶蛋白含量。本试剂盒仅供研究和工业生产使用。

 

试剂盒基本参数

灵 敏 度：≤ 0.056 ng/mL

检测范围：0.05 - 100 ng/mL

特 异 性：可检测胰蛋白酶蛋白，与其它重组表达系统相关蛋白无明显交叉反应。

重 复 性：板内、板间变异系数均< 15%。

工作时间：熟练实验人员可在1-1.5小时内完成一次测定。

有 效 期：6个月

 

试剂盒检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测样品中的胰蛋白酶蛋白含量。以抗胰蛋白酶抗体包被酶标板，样品或标准品中的胰蛋白酶与包被抗体结合，随之加入的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗胰蛋白酶抗体与上述抗原-抗体复合物结合，以TMB为显色体系，在450 nm波长（参考波长650 nm）处测OD值，胰蛋白酶浓度与 OD值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中胰蛋白酶的蛋白浓度。

 

试剂盒组成及保存

 

中文名称	规格	储存条件
抗体包被的ELISA酶标板（96孔可拆卸)	8孔×12条	2-8℃
冻干标准品（50 ng/支）(A1)	4支	2-8℃
辣根过氧化物酶化抗体浓缩液 (A2)	1瓶×0.03 mL	-20℃避光
浓缩标准品&样品稀释液&HRP-抗体稀释液（25X）(P1)	1瓶×5 mL	2-8℃
浓缩洗涤液（25X）(P2)	1瓶×20 mL	2-8℃
显色液A (P3)	1瓶×8 mL	2-8℃
显色液B (P4)	1瓶×8 mL	2-8℃避光
反应终止液 (P5)	1瓶×6 mL	2-8℃
封板覆膜	5张
避光袋	1份
产品说明书	1份
质检报告	1份

 

说明:

1.所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。

2.拆封后的试剂盒可在4℃保存，请在一周内使用完毕。

3.酶标抗体（A2）始终置于-20℃储存。

 

试验所需自备物品

1.酶标仪（滤光片波长450 nm和650 nm）

2.洗板机

3.高精度移液器，EP管、一次性吸头及洁净试管

4.37℃恒温箱，纯化水

5.洁净吸水纸

 

待测样品注意事项

1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或 -80℃（3个月内检测），避免反复冻融。未知样品应先离心取上清液进行上样操作，混悬液等样品影响测定结果。

2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释后再测。

3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液或自有稀释溶液，可能由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

 

检测前准备工作

1.稀释液配制

将浓缩标准品&样品&HRP-抗体稀释液用纯化水稀释（1：24）。

2.洗涤液配制

将浓缩洗涤液用纯化水稀释（1：24）。

提示:从冰箱中取出的样品稀释液或浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液温度应为室温）。所配工作液请当次实验使用，不建议多轮试验重复使用。

3.标准品配制

将标准品于1000转/分离心1分钟，加入的标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置1-2分钟，用移液器将其轻轻混匀（浓度为50 ng/mL），待其充分溶解后，然后进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。使用者可以根据实验需要稀释所需的浓度梯度配制。以50 ng/mL上限浓度点为例，配制以下浓度: 50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0 ng/mL。样品稀释液直接作为空白孔0 ng/mL。

4.HRP标记抗体工作液配制

HRP标记抗体应始终置于-20℃保存，请勿室温平衡，随用随取。首次使用时请先将抗体管低速离心，以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量（以100 μL /孔计算），实际配制时应多配制

100-200 μL。使用前3-5分钟，用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度（抗体：稀释液 = 1：250），建议即配即用。

倍比稀释方法示例

取7只EP管，每管中加入500 μL标准品&样品稀释液，从50 ng/mL的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL样品稀释液的EP管中混匀配成25 ng/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。

标准品稀释图例（以500 μL为例）

提示：最后一管直接作为空白孔。

 

 

​

洗涤方法

1.自动洗板机：每孔加入洗涤液350 μL，注入和吸出间隔60秒。

2.手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净厚吸水纸（或干布）上拍干，每孔加入洗涤液350 μL（此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗），浸泡45-60秒，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。

提示：推荐使用洗瓶冲洗，洗涤液溢出板孔不影响实验结果。若使用排枪，建议每次洗涤更换枪头，加样槽请不要与其他试剂混用，避免污染。

 

操作步骤

1.加样：将标准品工作液依次加入到板孔中，（此处建议每个浓度的工作液至少做2个复孔），每孔50 μL。待测样品加入到其他孔，每孔50 μL。随后，每孔中加入HRP-抗体工作液50 μL。加样完成后，轻微震荡10-15秒混匀，将酶标板覆膜并置于37℃条件下，避光静置孵育45分钟。

提示：

1)加样时应按照先样品后抗体的顺序加样。将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁。加入标记抗体时避免接触孔内液面造成样品间污染。加样时间尽量控制在10分钟内。

2)加样完毕后，应用微孔板振荡仪最低频率或手指轻微敲击酶标板四周10-15秒，已达到混匀的目的。切忌猛烈震荡使液体飞溅，影响实验结果。

3)无避光条件，可将酶标板置于避光袋中，于37℃条件下孵育。

2.洗涤：洗板机洗板：设置350 μL/孔洗涤液加液量，浸泡45-60秒，重复5次。

   手工洗板：弃去板内液体，甩干，在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL，浸泡45-60秒，重复此洗板步骤5次。

3.显色：每孔依次加入显色工作液A 50 μL/孔和显色工作液B 50 μL/孔。酶标板覆膜并置于37℃条件下避光孵育10分钟。

提示:

1)推荐使用排枪及加样槽加入显色工作液及终止液，尽量缩小由于加样时差造成的显色差异。

2)根据实际显色情况酌情缩短或延长，显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

4.终止：每孔加终止液50 μL，终止反应，终止反应后静置2-3分钟后，尽快读数。

提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头应避免接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。

5.读数：用酶标仪在450 nm波长（参考波长650 nm）测量各孔的光密度（OD450/650 nm值）。

提示: 请提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置检测程序。

 

结果判断

1.计算每组板孔的OD值或复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），绘出标准曲线（作图时亦可去掉空白组的值）。

2.推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（建议使用Logistic四参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线）等。

3.回收率：80-120%范围内。

4.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测。

5.若标准曲线R2值< 0.990，应当重新测定。

6.典型数据

由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

 

 

X-浓度（ng/mL）	50	25	12.5	6.25	3.125	1.56	0.78	0
Y-OD450/650 nm	1.903	1.450	0.944	0.546	0.287	0.144	0.090	0

 

​

 

 

注意事项

1.储存：在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染，否则可能会出现错误的结果。如近期不计划使用试剂盒，可将试剂盒整体放置于-20℃存放，待使用前将试剂盒内缓冲液平衡溶解即可。试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。

2.酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，甩干后不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋，按储存温度存放，建议1周内使用完毕。货架实验数据表明，2-8℃条件下，酶标板开封1-2周内随时间变化，酶标板整体显色可能会降低，但不影响标准曲线构建和样品测定。-20℃存放酶标板，3-6个月内随时间变化，酶标板整体显色可能会降低，但不影响标准曲线构建和样品测定。

3.加样：加样和加同一试剂时，第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间，从而明显的影响到测量值的准确性及重复性，每次的加样时间最好控制在10分钟之内，推荐设置复孔。

4.温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜，洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。

5.洗涤：洗涤过程中推荐使用洗板机。若手工洗板，反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸或干布上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。在读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。手动洗板和洗板机洗板存在整体显色差异属正常现象。

6.试剂配制：试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。所有试剂请按说明书指示请精确配制。

7.显色时间的控制：第一次使用本试剂盒时，在加入底物后，请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔5分钟），如梯度已经很明显，请提前加终止液终止反应，以避免颜色过深，影响酶标仪读数。

8.底物：请避光保存底物。在储存和温育时，避免强光直接照射。

9.混匀：加入样品和酶标抗体后，充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器，使用最低频率，如无微量振荡器，可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

10.不同批号的试剂盒组分不能混用。

11.数据分析：

1)由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等）等原因可能导致，复孔间平行度差异较大。建议在合理的取值范围内，以复孔读数的平均值为计算数值。

2)酶标仪差异分析：酶标仪具有450 nm和650 nm滤光片，可直接设置主/参波长进行读数；若酶标仪只具有450 nm滤光片，亦可直接读数计算，但整体显色数值会偏高0.05-0.10范围内，不影响标准曲线构建和样品浓度计算。

3)由于实验条件和操作习惯的差异性，可能会引起显色液轻微污染或本底偏高的现象。建议酶标仪设置选项直接设置：OD值减去空白孔的OD值作为矫正值，再行构建标准曲线和计算样品浓度。

12.关于样品的回收率

1)本试剂盒以测定胰蛋白酶的抗原性而非活力来推测蛋白残留量，因此试剂盒中标准品采用胰蛋白酶的消光系数（E1%1cm=13.6D, 即当A280 nm=1.36时，胰蛋白酶浓度为1mg/mL）来计算其蛋白含量，并采用内部质控以最大限度保持标准品含量的精确和恒定。

2)不同计量方法以及产品纯度的差别可以导致不同来源、不同批次产品中胰蛋白酶的蛋白含量不完全一致，也会造成回收率的差异。为避免上述因素影响，建议将用作回收率测试的样品采用分光光度法

（A280 nm）估算蛋白含量，再稀释至适合的浓度用于回收率测试，尽量减少回收率的误差。

13.运输与存放

本实验室测试数据表明：2-8℃试剂盒整体存放7天（货架时间）不影响试剂盒性能，-20℃试剂盒整体存放1个月（货架时间）不影响试剂盒性能。

 

问题分析

若实验结果有问题，请及时对显色结果拍照，并妥善保存未使用板条及试剂，然后联系技术支持。也可参考以下信息以找出原因。

 

问题描述	可能原因	相应对策
1.标准曲线梯度差	吸液或加液不准	检查移液器和吸头；保证加样量一致性
	标准品稀释不正确	溶解标准品时稍微旋转瓶身，轻轻混匀使粉末完全溶解
	洗涤不完全	保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量
2.显色很弱或无色	温育时间太短	保证充足的温育时间
	实验温度不正确	使用推荐的实验温度
	试剂体积不够或漏加	检查吸液及加液过程，保证所有试剂按顺序足量添加
	稀释不正确
3.显色过高	抗体稀释不正确	抗体吸取不准确导致抗体浓度过高
	显色时间过长	适当缩短显色时间
4.读数数值低	酶标仪设置不正确	在酶标仪上检查波长和滤光片装置
		提前打开酶标仪预热
5.变异系数大	加液不正确	检查加液情况
6.背景值高	检测抗体的工作浓度过高	使用推荐的稀释倍数
	酶标板洗涤不完全	重新仔细阅读操作步骤，保证每步清洗完全；如果用自动洗板机，请检查所有的出口是否有堵塞；是否使用试剂盒配备的洗涤液
	洗液或洗板机有污染	配制新鲜的洗液或清理洗板机或改为人工洗板
7.灵敏度低	ELISA试剂盒保存不当	按说明书要求保存相关试剂
	读数前未终止	OD读数前应在每孔中加入终止液