K0604-RSN 核酸酶残留量检测试剂盒（荧光底物法）

 

试剂盒简介

核酸酶残留量检测试剂盒（荧光底物法）是一款基于荧光底物法快速、高灵敏检测供试品中核酸酶残留量的试剂盒。可用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的核酸酶活性含量。本试剂盒专一性强、灵敏度高、检测快速、性能稳定。

核酸酶是一种普遍存在于环境和生物材料中的酶，能够降解DNA和RNA，对许多实验都会造成干扰。在生物工程、疫苗生产、制药和食品加工等领域，核酸酶残留会对产品质量产生重要影响。全能核酸酶等广谱核酸酶可以降解所有形式的DNA和RNA，且不具有碱基识别特异性。因此，全能核酸酶常用于重组蛋白药物、疫苗样品、细胞和基因治疗病毒样品中的核酸去除，降低核酸残留毒性风险，提高产品安全性；另外，在蛋白分析样品制备、改善重组蛋白纯化工艺、提高蛋白产量、细胞冻存等方面也可通过使用全能核酸酶处理核酸来达到理想实验效果。

通过核酸酶处理生物制品的过程中，可能会引入微量核酸酶残留，会对后续生物制品的应用和安全性造成一定的影响。因此，在生物制品的安全性监管中，核酸酶的残留量是衡量生物制品质量的重要指标之一。

本试剂盒采用荧光底物法，可实现核酸酶的快速检测。使用的荧光底物是一种修饰的DNA寡核苷酸探针，其一端具有VIC荧光基团（F），一端具有Dabcyl淬灭基团（Q）。当两个基团距离较近时，会导致荧光分子自身的荧光强度衰减。当底物被核酸酶切割时，底物的首尾两端分离，荧光基团和淬灭基团分开，VIC荧光基团会发出荧光。检测原理和流程如图1所示。因为荧光增加的速度和核酸酶的活性成正比，这样通过荧光检测可以实时或动态检测核酸酶活性。

本试剂盒提供核酸酶标准品，可以通过设置标准曲线，计算供试品中的核酸酶残留量。   

 

图1  核酸酶残留检测原理和流程

 

 

试剂盒组分

规格：100 rxns

 

有效期

规定储存条件下12个月，具体详见试剂盒标签。

 

运输条件

干冰运输，-20±5℃保存。

 

注意事项

1.检测之前请仔细阅读本说明书，按照说明书内容进行规范操作。

2.加样前试剂应置于冰上，并且整个操作在冰上进行，试剂温度过高会影响检测结果。

3.试剂使用结束后尽快放置推荐的储存条件下，避免在常温或高温条件下存放时间过长。

4.直接与标准品和供试品接触的器具应为低吸附、无核酸酶的塑料制品或其他适宜器具，试验中采用的耗材均需无核酸酶。

 

实验所需但试剂盒中未含材料

· 10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL不等的低吸附、无核酸酶、带滤芯吸头

· 1.5 mL、5 mL低吸附、无核酸酶离心管

· 无核酸酶黑色酶标板

 

实验所需但试剂盒中未含设备

· 漩涡振荡器

· 瞬时离心机

· 10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL移液器，10-100 μL八通道移液器

· 超净台或生物安全柜

· 酶标仪

 

操作过程

 

1.酶标仪的设置

打开设备并设置程序，酶标仪检测温度为37℃，激发波长为530 nm，发射波长为580 nm，选择并固定的荧光增益（不同仪器增益效果不同，可根据仪器使用经验确定）。选择动力学测定模式，每1分钟读取一次数值，持续记录20分钟的测定结果。

 

1.试剂盒的准备工作

2.1 试剂解冻：将试剂盒中的10X RSN Buffer、Nuclease-free Water和1X TE Buffer放置在室温下充分解冻。

2.2 荧光底物配制：本试剂盒提供的荧光底物为干粉，首次使用试剂盒时，需用1 mL 1X TE Buffer重悬荧光底物。取出荧光底物管，8000 rpm离心3分钟，在超净台中轻轻打开管盖防止干粉飞溅，加入1 mL 1X TE Buffer，充分混匀（漩涡震荡3-5秒，瞬时离心3-5秒，重复上述过程2遍）。

2.3 标准品&样本稀释液（0.1X RSN Buffer）的配制：将10X RSN Buffer用Nuclease-free Water稀释为0.1X，例如取10 μL 10X RSN Buffer，加入990 μL Nuclease-free Water，充分混匀（漩涡震荡3-5秒，瞬时离心3-5秒，重复上述过程2遍）即得1 mL的0.1X RSN Buffer。

 

1.样本制备

3.1 供试品可用0.1X RSN Buffer进行复溶或稀释，如果样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况做适当稀释倍数后再测。

3.2 供试品为复杂背景基质（如高浓度的盐离子、表面活性剂或pH过酸过碱等），可能会导致检测值出现偏差。

 

1.全能核酸酶标准品溶液的稀释

全能核酸酶标准品稀释过程中注意要充分混匀。

以全能核酸酶标准品250 KU/mL为初始浓度，用0.1X RSN Buffer进行梯度稀释，稀释浓度依次为1000 U/mL、10 U/mL、5 U/mL、2.5 U/mL、1 U/mL、0.5 U/mL、0.2 U/mL。操作如下：

4.1 将全能核酸酶标准品和0.1X RSN Buffer漩涡震荡3-5秒，瞬时离心3-5秒，重复上述过程2遍充分混匀后置于冰上备用。

4.2 取1支洁净的5 mL离心管，标记为1000 U/mL，加入2490 μL 0.1X RSN Buffer和10 μL全能核酸酶标准品（250 KU/mL），即稀释为1000 U/mL，漩涡震荡3-5秒后快速离心3-5秒，重复上述过程2遍使得全能核酸酶标准品与0.1X RSN Buffer充分混匀。

4.3 取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为ST①，ST②，ST③，ST④，ST⑤，ST⑥。按如下稀释方法进行稀释，稀释后的样本置于冰上备用。

 

稀释管	稀释比例	终浓度
ST①	10 μL 1000 U/mL +990 μL 0.1X RSN Buffer	10 U/mL
ST②	400 μL ST①+400 μL 0.1X RSN Buffer	5 U/mL
ST③	400 μL ST②+400 μL 0.1X RSN Buffer	2.5 U/mL
ST④	400 μL ST③+600 μL 0.1X RSN Buffer	1 U/mL
ST⑤	400 μL ST④+400 μL 0.1X RSN Buffer	0.5 U/mL
ST⑥	320 μL ST⑤+480 μL 0.1X RSN Buffer	0.2 U/mL

 

注: 

1.已融化未使用的10X RSN Buffer可保存于2-8℃，如长时间不用，请放置于-20±5℃。

2.标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，如需要，可适当扩大或缩小线性范围，不少于5个稀释度。

3.每个梯度标准品溶液稀释时需充分混匀。

4.每次更换吸头，注意规范操作，避免管与管直接交叉污染。

 

1.检测操作步骤

加样前请确保仪器设置完成处于待检状态（参考1. 酶标仪的设置）。

取黑色酶标板，每孔分别依次加入10X RSN Buffer 10 μL、荧光底物溶液10 μL，以及标准品溶液、供试品溶液或空白溶液80 μL（建议至少双孔平行测定），立即放入酶标仪中进行荧光检测。推荐用8通道移液器快速加样，时间建议控制在2分钟以内，整个操作需在冰上进行。

 

步骤	Blank	Standard	Sample
10X RSN Buffer	10 μL	10 μL	10 μL
荧光底物溶液	10 μL	10 μL	10 μL
0.1X RSN Buffer	80 μL	—	—
全能核酸酶标准品	—	80 μL	—
供试品	—	—	80 μL

 

注: 

1.建议测定总时间为20分钟，每1分钟读取一次数值。客户可根据样本中核酸酶含量适当调整检测时间，但是需确保至少获得6个点以上的连续数据。

2.检测前确保混匀，如果酶标仪具有自动振荡混匀功能，则选择仪器自动混匀（例如，振板模式：线性，持续时间：10秒，线性频率：567 cpm），如无则加样后立即吹打混匀。

 

1.结果分析

6.1 选取标准品溶液与供试品溶液的线性反应阶段，以时间为横坐标，以RFU为纵坐标，分别计算标准品溶液和供试品溶液的线性回归方程，其斜率即为标准品溶液和供试品溶液的RFU变化率，每1 mL含0.2 U的标准品溶液线性回归方程的相关系数应不低于0.95。如仪器可直接计算Vmax和R2，则可直接使用仪器给出的数据进行分析。

6.2 以标准品浓度为横坐标，以相应的RFU变化率（或仪器计算的Vmax）为纵坐标，计算线性回归方程，其相关系数应不低于0.98。根据供试品溶液的荧光强度变化率（或仪器计算的Vmax）和稀释倍数计算供试品中核酸酶的残留量。